應(yīng)用iTRAQ技術(shù)快速鑒定稻米品質(zhì)差異蛋白的方法分析

閘雯俊 游艾青

摘要：以鄂中5號(hào)和桂朝2號(hào)為材料，應(yīng)用iTRAQ技術(shù)快速鑒定稻米品質(zhì)差異蛋白，從而根據(jù)差異蛋白快速和有效地篩選到與水稻（Oryza sativa L.）品質(zhì)相關(guān)聯(lián)的候選基因。結(jié)果表明，鄂中5號(hào)、桂朝2號(hào)共鑒定出水稻顯著差異蛋白61個(gè)，其中上調(diào)蛋白21個(gè)，下調(diào)蛋白40個(gè)。該技術(shù)可廣泛應(yīng)用于水稻品質(zhì)性狀的研究和開發(fā)并且結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育高檔優(yōu)質(zhì)水稻品種。

關(guān)鍵詞：水稻（Oryza sativa L.）;iTRAQ技術(shù);差異蛋白;鑒定

中圖分類號(hào)：S511 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）17-0175-03

Abstract： Using Ezhong No. 5 and Guichao No. 2 as materials， the iTRAQ technology was used to quickly identify rice quality differential proteins， so that candidate genes related to rice quality can be rapidly and effectively screened based on the differential proteins. The results showed that Ezhong No. 5 and Guichao No. 2 identified a total of 61 significantly different proteins in rice， including 21 up-regulated proteins and 40 down-regulated proteins. This technology can be widely used in the research and development of rice quality traits and combined with transgenic technology to cultivate high-quality rice varieties.

Key words： rice（Oryza sativa L.）; iTRAQ; differential protein; identify

水稻（Oryza sativa L.）是世界主要糧食作物之一，全球超過一半人口都以水稻作為主食。估計(jì)到2025年，世界水稻產(chǎn)量要比現(xiàn)在增長(zhǎng)60%才能夠滿足需要。中國(guó)是水稻生產(chǎn)大國(guó)，水稻常年種植面積約 ? ? ? 3 000萬(wàn)hm2，占世界水稻種植總面積的1/4。因此，水稻的種植安全與中國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民生活密不可分。

目前公認(rèn)的高檔優(yōu)質(zhì)稻是指稻米的理化品質(zhì)優(yōu)異、米粒細(xì)長(zhǎng)、外觀晶瑩透明、適口性好、商品價(jià)位高、可與泰國(guó)香米相媲美的一類水稻品種。試驗(yàn)表明，優(yōu)質(zhì)稻的直鏈淀粉含量為13%～17%，膠稠度65～85 mm，長(zhǎng)寬比3.4以上。高檔優(yōu)質(zhì)稻的理化指標(biāo)與國(guó)標(biāo)不完全一致，高檔優(yōu)質(zhì)稻品種在注重精米理化指標(biāo)的同時(shí)，更注重外觀品質(zhì)和適口性，做到好看更好吃。而湖北省高檔優(yōu)質(zhì)稻種植面積一直徘徊在6萬(wàn) hm2 左右，僅占水稻種植面積的3% ，高檔優(yōu)質(zhì)稻產(chǎn)業(yè)化開發(fā)明顯滯后，與市場(chǎng)需求不相適應(yīng)[1，2]。

同位素相對(duì)和絕對(duì)定量標(biāo)記（Isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）是最近發(fā)展起來的一種新型定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，但目前尚未發(fā)現(xiàn)用于快速鑒定稻米品質(zhì)差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究的報(bào)道。利用iTRAQ這一高通量、準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)組學(xué)研究手段來研究與水稻品質(zhì)相關(guān)的候選基因，可廣泛應(yīng)用于水稻品質(zhì)性狀的研究和開發(fā)并且結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育高檔優(yōu)質(zhì)水稻品種。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻品種為鄂中5號(hào)和桂朝2號(hào)子粒。

1.2 方法

1.2.1 iTRAQ標(biāo)記 采用丙酮沉淀法提取處理組與對(duì)照組水稻子粒蛋白質(zhì)。對(duì)提取后的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行還原烷基化處理，用考馬斯亮蘭法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)后取等量蛋白質(zhì)樣品Trypsin酶解，用iTRAQ 117、iTRAQ 115 標(biāo)記鄂中5號(hào)蛋白質(zhì)，iTRAQ 113、iTRAQ 119標(biāo)記桂朝2號(hào)蛋白質(zhì)，最后將標(biāo)記好的4組樣品等量混合，應(yīng)用強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜法對(duì)混合后的肽段進(jìn)行預(yù)分離，隨后再進(jìn)行液相分離和質(zhì)譜分析。

1.2.2 差異蛋白的選擇 如果某個(gè)蛋白的差異倍數(shù)（Fold change）>1.20或<0.83，同時(shí)經(jīng)過統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，P<0.05便可認(rèn)為是差異蛋白[3]。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)查庫(kù)、定量分析的過程：用ProteinPilot軟件的Paragon算法進(jìn)行肽段、蛋白鑒定和定量，檢索數(shù)據(jù)庫(kù)為NCBI水稻種屬非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)。搜索參數(shù)設(shè)置為胰蛋白酶，全酶切方式，最大漏切位點(diǎn)為2，固定修飾為半胱氨酸的甲基甲基硫代甲砜烷基化，可變修飾為甲硫氨酸的氧化，肽段N端和賴氨酸的iTRAQ修飾;為降低假陽(yáng)性結(jié)果，蛋白鑒定標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為ProtScore≥1.3，同時(shí)最少使用2條置信度≥ 95%的肽段進(jìn)行蛋白定量;結(jié)果經(jīng)自動(dòng)偏離校正以便消除標(biāo)記樣品混合時(shí)引入的誤差。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)差異蛋白基因 取-80 ℃保存的水稻總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。在 Roteogene 6000TM 定量PCR儀上進(jìn)行10 μL體系的 PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件如下： 94 ℃ 預(yù)變性2 min，以30～40 個(gè)循環(huán)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增（94 ℃變性 20 s，55 ℃ 退火 15 s，72 ℃延伸 20 s），每個(gè)樣品 3 個(gè)重復(fù)，取平均值。采用 2-ΔΔCt 方法比較不同樣品基因表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 GO功能顯著富集結(jié)果

所有被鑒定蛋白質(zhì)編碼基因的GO功能顯著富集，質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)的GO功能產(chǎn)物屬性顯著富集（-logP≥1.5）在細(xì)胞組分中，包括細(xì)胞、細(xì)胞部分、細(xì)胞器、膜、細(xì)胞器部分、膜部分、大分子復(fù)合體、細(xì)胞外區(qū)域、膜封閉腔、細(xì)胞外區(qū)域部分（圖1）;其次，GO功能產(chǎn)物屬性顯著富集（-logP≥1.5）在分子功能中，包括催化活性、結(jié)合活性、分子功能調(diào)節(jié)子、結(jié)構(gòu)分子活性、營(yíng)養(yǎng)庫(kù)活性、分子傳感器活性、抗氧化活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性（圖2）;最后，GO功能產(chǎn)物屬性顯著富集（-logP≥1.5）在生物過程中，包括代謝過程、細(xì)胞過程、單組織過程類別、對(duì)刺激的反應(yīng)、細(xì)胞成分組織或生物發(fā)生、生物調(diào)節(jié)、定位、生物過程調(diào)節(jié)、信號(hào)、解毒、多細(xì)胞組織過程、發(fā)育過程、繁殖、多生物過程、生殖過程（圖3）。

2.2 蛋白質(zhì)的鑒定及定量

鑒定出水稻鄂中5號(hào)/桂朝2號(hào)（E5/G2）的顯著差異蛋白61個(gè)，其中上調(diào)蛋白21個(gè)，下調(diào)蛋白40個(gè)（圖4）。

2.3 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的功能注釋及其分類

所有具有高度同源性的差異表達(dá)蛋白被分配到16個(gè)COG類別（圖5）。其中，僅限一般功能預(yù)測(cè)類蛋白（7個(gè)）代表最大的功能類別，其次有6個(gè)蛋白參與碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、5個(gè)蛋白參與能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化和5個(gè)蛋白參與翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生。3個(gè)蛋白參與RNA加工和修飾，3個(gè)蛋白參與翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶，2個(gè)蛋白屬于功能未知、2個(gè)蛋白參與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，2個(gè)蛋白參與無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、2個(gè)蛋白參與細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌和囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)，2個(gè)蛋白參與次生代謝產(chǎn)物的生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝。參與細(xì)胞壁/膜/包膜生物發(fā)生、防御機(jī)制、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的蛋白均只有1個(gè)。

3 小結(jié)與討論

本研究共篩選到 61個(gè)水稻差異表達(dá)蛋白，功能分析表明其主要集中于細(xì)胞組分、分子功能、生物過程。在細(xì)胞組成方面主要分布于細(xì)胞和細(xì)胞部分，分子功能主要涉及催化活性和結(jié)合活性，生物過程主要涉及細(xì)胞過程和代謝過程。采用 iTRAQ 技術(shù)的水稻定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，有效地篩選到與水稻品質(zhì)相關(guān)聯(lián)的候選基因;同時(shí)可廣泛應(yīng)用于水稻品質(zhì)性狀的研究和開發(fā)并且結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)來培育高檔優(yōu)質(zhì)水稻品種。

參考文獻(xiàn)：

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