柚皮素聯(lián)合5-FU對大腸癌細胞增殖和遷移的影響*

周 躍，周燕紅

(1.湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學院五官醫(yī)學院)

大腸癌 (colorectal cancer，CRC) 是一種高度侵襲性的人類惡性腫瘤，通常診斷時已為晚期[1]。據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)(international agency for research on cancer) 2018年估計，CRC已成為第三大最常見的惡性腫瘤和第二大癌癥死亡原因，全球每年約有180萬新病例和90萬人死亡[2]。目前，除手術外，CRC患者的治療主要依靠化療，尤其是晚期CRC患者。化療藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)一直是治療CRC的一線方案[3]。由于5-FU對正常細胞有毒性，患者治療時容易產(chǎn)生耐藥性和嚴重的副作用，在晚期CRC中5-FU單藥治療的總有效率被限制在10%～15%[4]。因此，迫切需要改進以5-FU為基礎的化療方法治療CRC。

國內(nèi)外藥理研究表明，柚皮素(NAR)是一種具有多種生物活性的柑橘類黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗病毒、神經(jīng)保護、腎保護、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、促進碳水化合物代謝等多種生物活性，被認為是癌癥的一種潛在治療藥物[5-6]。本實驗采用體外培養(yǎng)人大腸癌LoVo細胞的方式，來探討柚皮素與5-FU聯(lián)用對大腸癌LoVo細胞增殖、遷移的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人大腸癌LoVo細胞購自中國科學院細胞庫。柚皮素購自Sigma公司；5-FU購自MCE公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自Procell公司；青鏈霉素和胎牛血清購自Gibco公司；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購自Beyotime 公司；Transwell小室購自Falcon公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

將大腸癌LoVo細胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640的完全培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細胞的密度達到80%時，按1∶3的比例對細胞進行傳代。

1.3 CCK-8法測定細胞增殖能力

取處于對數(shù)生長期，生長狀態(tài)良好的細胞，用RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度到5×104/mL，接入96孔板，每孔100μL細胞懸液，同時設空白組，37℃、5%CO2培養(yǎng)24h(在細胞孔周圍孔內(nèi)加入100μL無菌PBS)。細胞貼壁后，棄去上清，分別加入柚皮素(0、100、200、400、600、800μmol/L)處理24、48、72h，5-FU(0、5、10、20、40、80、160、320μmol/L)處理48h，每組6個復孔，每孔加入20μL CCK-8試劑，置于37℃培養(yǎng)箱中4h。酶標儀450nm測定各孔吸光值OD。按下式計算藥物對腫瘤細胞生長的抑制率(inhibitory rate，IR)：IR%=(實驗孔OD值-空白孔OD值)/(正常對照孔OD值-空白孔OD值)×100%。

1.4 藥物聯(lián)合作用評價

將不同濃度的5-FU與柚皮素按1∶4固定比分別聯(lián)合用藥，柚皮素濃度為(2.5、5、10、20、40、80 μmol/L)，5-FU濃度為(10、20、40、80、160、320 μmol/L)，CCK-8測定各組增殖抑制率。采用Chou-Talalay方法[7]，研究了柚皮素與5-FU之間的藥物相互作用，并利用Compusyn軟件計算了其聯(lián)合指數(shù)(CI)的結(jié)果，其中CI<1為協(xié)同作用，CI=1為添加作用，CI>1為拮抗作用。使用Compusyn 1.0軟件生成效應-聯(lián)合指數(shù)曲線，即Fa-CI圖，F(xiàn)a為藥物作用效應。

1.5 Transwell測定細胞遷移能力

將LoVo細胞分為4組：正常對照組、柚皮素組、5-FU組、柚皮素+5-FU組。①正常對照組：僅加含RPMI完全培養(yǎng)基；②柚皮素組：80μmol/L濃度的柚皮素作用；③5-FU組：20μmol/L濃度的5-FU；④柚皮素+5-FU組：80μmol/L柚皮素和20μmol/L的5-FU；各組的細胞作用時間為48h。將無血清RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細胞，稀釋細胞濃度至3×105/mL，備用；在24孔板中預先加入800μL 10% FBS 的RPMI-1640培養(yǎng)基(含雙抗)，并放入Transwell小室，在上室分別接入200μL各組細胞懸液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h；取出Transwell小室，用PBS清洗，70%冰乙醇溶液固定細胞1h；用0.5%結(jié)晶紫染液染色，PBS清洗，用干凈的棉球?qū)⑸鲜乙粋?cè)的未遷移的細胞擦干凈，顯微鏡下觀察拍照。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 柚皮素、5-FU單獨用藥對LoVo細胞增殖的影響

不同濃度柚皮素對LoVo細胞均有不同程度的抑制作用，并呈濃度-時間依賴性(P<0.05)，見圖1。處理48h時后，與24h相比，柚皮素的細胞抑制顯著增強(P<0.05)；處理72h時后，與48h相比，柚皮素細胞增殖抑制率無差異(P>0.05)，因此，后續(xù)實驗確定48h為最佳的作用時間，見表1。5-FU 在48h的增殖抑制率也隨著濃度顯著上升，見圖2。48h時，柚皮素的IC50為329.30μmol/L，5-FU的IC50為87.61μmol/L。

表1 柚皮素干預LoVo的細胞增殖抑制率

圖1 柚皮素對LoVo細胞的增殖抑制作用(n=6)

與對照組比較，**P<0.01；與前一濃度組相比，#P<0.05,n=6

2.2 柚皮素聯(lián)合5-FU的對LoVo細胞的增殖抑制作用

相對于單獨使用柚皮素或者5-FU，聯(lián)合用藥顯著增強LoVo細胞的增殖抑制率且各濃度下CI<1(見圖3、圖4)，結(jié)果提示柚皮素聯(lián)合5-FU對LoVo細胞有協(xié)同抑制作用。5-FU (20μmol/L) + NAR(80μmol/L)的濃度組合，該濃度下柚皮素和5-FU聯(lián)合用藥組較單獨用藥組均有顯著性差異(P<0.01)，且增殖抑制率接近聯(lián)合用藥的半數(shù)抑制率，提示這兩種濃度的組合抑制 LoVo細胞增殖作用比較明顯，并且具有較高協(xié)同效果(0.4≤CI<0.6)。見表2。

聯(lián)合組與柚皮素組比較，##P<0.01；聯(lián)合組與5-FU組比較，**P<0.01

圖4 柚皮素聯(lián)合5-FU對LoVo細胞的效應與聯(lián)合指數(shù)曲線

表2 5-FU聯(lián)合柚皮素對LoVo細胞體外增殖48h的聯(lián)合用藥指數(shù)CI

2.3 柚皮素聯(lián)合5-FU對LoVo細胞的遷移作用

采用Transwell小室實驗對LoVo細胞的細胞遷移能力進行了分析。對照組、柚皮素(80μmol/L)、5-FU(20μmol/L)、聯(lián)合組分別作用細胞后，穿膜細胞數(shù)分別為(323.20±17.97)、(167.60±22.80)、(131.20±8.77)、(82.20±7.14)個。與正常對照組細胞相比，單純使用5-FU或柚皮素治療細胞遷移能力均下降(P<0.01)，而聯(lián)合治療的兩個藥物較單獨用藥有更顯著的抑制細胞遷移能力(P<0.01)。見圖5。

A.對照組 B.柚皮素組 C.5-FU組 D.柚皮素+5-FU組

3 討 論

目前，大腸癌依舊是常見的惡性腫瘤，晚期患者死亡率高，25%的患者在診斷時已發(fā)生轉(zhuǎn)移性疾病[8]。目前CRC的治療以手術和化療為主。5-FU是大腸癌的常用化療藥物，以5-FU為主的聯(lián)合化療也是結(jié)直腸癌治療的常用方案，但是毒副作用與耐藥性限制其治療效果。眾多研究已表明大腸癌可以通過早期診斷和聯(lián)合化療提高生存率。研究一些天然化合物發(fā)現(xiàn)它們可能對傳統(tǒng)的細胞毒性治療敏感，增強藥物的有效濃度，加強兩者的聯(lián)合作用，或?qū)δ[瘤細胞產(chǎn)生特異性的細胞毒性作用，能降低抗腫瘤藥物的耐藥性，即使在高劑量下也可減輕其毒性作用[9]。中藥配合化療藥物治療大腸癌，不僅可以明顯減輕化療的副作用，提高患者耐藥性和改善患者氣血、增強療效，而且作為一種新療法，已逐漸進入結(jié)直腸癌的臨床治療中，在晚期患者的治療中療效顯著。因此，尋找高效、低毒的天然藥物降低化療藥物的毒性、增強其療效，成為大腸癌治療研究熱點。

研究表明，柑橘類黃酮類化合物與化療藥物聯(lián)合治療對腫瘤細胞的生長也有很好的抑制效果，可以作為輔助化療藥物的來源[10]。柚皮素屬柑橘類黃酮類化合物，具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抗腫瘤等特性，能抑制皮膚癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌、肺癌、肝癌等多種癌癥，也具有化學預防、毒副作用小的性質(zhì)，柚皮素也被認為是癌癥的一種潛在輔助化療藥物，能協(xié)同增加化療藥的抗癌效果[5]。如柚皮素和他莫昔芬聯(lián)合處理ER+型乳腺癌較單藥處理有顯著抗增殖、抑制細胞遷移及誘導細胞凋亡等作用[11]。柚皮素對前列腺癌細胞的增殖和遷移具有明顯的抑制作用，與紫杉醇聯(lián)用后對LNCaP前列腺癌細胞的生長有協(xié)同作用[12]。

在本實驗中，我們評估了5-FU和天然化合物柚皮素聯(lián)合使用對大腸癌細胞增殖和遷移的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種化合物的組合給藥方式，低劑量的5-FU，表現(xiàn)出良好的協(xié)同抗增殖作用，能有效抑制細胞的遷移能力，與已報道過的5-FU聯(lián)合其他化合物的抗癌結(jié)果相似[13-15]。

綜上所述，柚皮素聯(lián)合5-FU可以有效抑制大腸癌增殖、遷移，但是其機制和體內(nèi)實驗效果仍需要深入進行探究。