L-半胱氨酸鹽酸鹽對餅干中4種有害醛類和熒光晚期糖基化終產(chǎn)物的影響

翁 婷 鄭 潔 黃才歡 歐仕益

(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510000)

L-半胱氨酸鹽酸鹽是一種無色至白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，有輕微特殊氣味和酸味。對亞硝酸鹽具有一定的清除能力[1]，具有抗氧化和防酶促褐變作用，能通過延緩龍眼氧化而保持果實品質(zhì)[2]。L-半胱氨酸鹽酸鹽能夠減輕愈傷組織的褐變[3]，具有防止或推遲褐變的作用[4-5]。美拉德反應(yīng)香精制備中，L-半胱氨酸鹽酸鹽能賦予肉香味并降低產(chǎn)品顏色[6]。

同時，L-半胱氨酸鹽酸鹽還是面粉改良劑[7]。餅干是常見的烘焙食品之一，其主要成分還原糖和蛋白質(zhì)(氨基酸)在烘焙過程中發(fā)生美拉德反應(yīng)賦予餅干獨特的色、香、味，但同時會伴隨一些有害物質(zhì)的產(chǎn)生，如5-羥甲基糠醛、α-二羰基化合物和晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)[8-9]等。5-羥甲基糠醛對人體黏膜、橫紋肌和內(nèi)臟具有刺激和損傷作用，具有基因毒性和遺傳毒性，且是衡量食品褐變的指標(biāo)[10-13]。典型的α-二羰基化合物，如3-脫氧葡萄糖醛酮(3-DG)、乙二醛(GO)、丙酮醛(MGO)是AGEs的主要前體物質(zhì)[14]。α-二羰基化合物不僅存在于食品中，還在人體中產(chǎn)生，與一些慢性或者老年化疾病有關(guān)，如動脈粥樣硬化[15]、糖尿病[16]、阿爾茨海默癥[17]等疾病。還原性物質(zhì)能夠有效抑制GO、MGO和AGEs的形成[18-19]。課題組[20]36-46[21]前期研究表明，半胱氨酸在生理條件下能與HMF、3-DG、GO、MGO形成加合物并降低細(xì)胞毒性。L-半胱氨酸鹽酸鹽應(yīng)用在韌性餅干中用來改良其品質(zhì)[22]，但是否能有效降低以上有害醛類和熒光AGEs還未見報道。

研究擬將不同劑量的L-半胱氨酸鹽酸鹽添加至面團中，研究其對餅干外觀和有害物質(zhì)HMF、3-DG、GO、MGO、熒光AGEs含量的影響，以期為L-半胱氨酸鹽酸鹽在烘焙食品中的應(yīng)用提供有益指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

低筋小麥粉：濰坊風(fēng)箏面粉有限責(zé)任公司；

棕櫚油：廣州珠烽進(jìn)出口貿(mào)易有限公司；

蔗糖、氯化鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫銨、乙醇、鄰苯二胺：分析純，天津大茂有限公司；

5-羥甲基糠醛：純度98%，北京百靈威科技有限公司；

乙二醛、丙酮醛：質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%水溶液，北京百靈威科技有限公司；

3-脫氧葡萄糖醛酮：加拿大TRC有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

pH計：FE22型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

微型旋渦混合儀：XW-80A型，上海滬西分析儀器廠；

高效液相色譜儀：LC-20AT型，日本島津公司；

色譜柱：ZORBAX SB-Aq型，4.6 mm×250 mm，5 μm，美國安捷倫有限公司；

壓面機：WA-BYM-15SFT型，江蘇無錫市麥威電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 餅干的制備

(1) 配方：根據(jù)Zou等[23]的配方略有修改(見表1)。

(2) 制作步驟：先將氯化鈉、蔗糖、碳酸氫銨、碳酸氫鈉和半胱氨酸鹽酸鹽分別溶于水中，再加油混合均勻，然后加入小麥粉制備成面團。L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加量分別為0.0，0.3，0.6，1.0，1.5 g/kg，將面團用壓面機輥壓3次，制成厚度為3 mm的面皮，再用餅干模具制成長48 mm 和寬36 mm大小的餅干，置于預(yù)熱30 min后的烤箱中，在190 ℃下分別烘焙10 min和15 min后放置在干燥器中保存。

1.2.2 餅干pH與色度的測定 將1 g烘焙10 min的餅干磨碎，在15 mL水中超聲60 min，然后在室溫下靜置1 h，用pH計測其上清液的pH值，每處理重復(fù)3次。

表1 餅干配料

將焙烤10 min的餅干冷卻至室溫后，使用白度儀檢測餅干的L*(亮度)、a*(紅色/綠色)和b*(黃色/藍(lán)色)，每處理重復(fù)5次。

1.2.3 HMF的測定 將1 g烘焙15 min的餅干磨碎，在20 mL水中渦旋5 min充分混勻，10 000 r/min離心10 min，再加入10 mL水按重復(fù)提取一次，收集上清液用0.22 μm濾膜過濾。根據(jù)Huang等[24]的程序進(jìn)行HPLC分析，分離操作在ZORBAX SB-Aq柱上進(jìn)行，采用5%的甲醇溶液等度洗脫25 min。樣品進(jìn)樣體積10 μL，流速0.6 mL/min，柱溫40 ℃。HMF在284 nm 處檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=106 862X+1 767 141(R2=0.997，線性范圍10～600 μg/mL)。每處理重復(fù)3次。

1.2.4 GO、MGO、3-DG的檢測 采用衍生法(形成喹喔啉衍生物)、HPLC檢測。將1 g烘焙15 min的餅干磨碎，在20 mL水中渦旋5 min充分混勻，10 000 r/min離心10 min，再加入10 mL水重復(fù)提取一次。取1 mL上清液與100 μL 鄰苯二胺溶液(1.08 g OPD溶于10 mL甲醇中)渦旋1 min混合均勻，置于60 ℃ 的水浴鍋中避光衍生24 h，將衍生完的溶液通過0.22 μm 濾膜過濾，根據(jù)Ou等[25]的方法稍作修改進(jìn)行HPLC分析，樣品分離在ZORBAX SB-Aq柱上進(jìn)行，流動相A為0.1%乙酸—水，流動相B為甲醇，梯度洗脫，梯度程序設(shè)置：B=28%～43%，0.00～15.00 min；B=43%～75%，15.01～30.00 min；B=75%，30.01～35.00 min。進(jìn)樣量50 μL，流速1 mL/min，柱溫40 ℃。在314 nm處對GO、MGO和3-DG進(jìn)行定量檢測，分別繪制GO、MGO和3-DG的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，其中GO的濃度設(shè)置為0.01，0.10，0.20，0.30，0.40 μmol/mL，MGO濃度為0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 μmol/mL，3-DG濃度為10，20，40，60，80，100 μg/mL，得到GO、MGO和3-DG的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程如下：GO為Y=13 061 332X+47 122(R2=1.000，線性范圍0.01～0.40 μmol/mL)；MGO為Y=9 535 572X+22 714(R2=1.000，線性范圍0.1～1.0 μmol/mL)；3-DG為Y=96 487X-45 331(R2=0.998，線性范圍10～100 μg/mL)。每處理重復(fù)3次。

1.2.5 熒光AGEs的測定 將1 g烘焙10 min的餅干磨碎，在5 mL水中超聲20 min，10 000 r/min離心20 min，收集上清液。沉淀用2 mL水再提取兩次，合并上清液后用0.45 μm濾膜過濾，用水定容至10 mL。將上清液注入96孔黑色平板，每孔100 μL。參照Sadowska-Bartosz等[26]的方法，分別在325/440，330/415，365/480，325/434 nm(激發(fā)波長/發(fā)射波長)下檢測熒光AGEs、二酪氨酸、犬尿氨酸和N-甲酰犬尿氨酸。每處理重復(fù)9次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每次處理重復(fù)3次以上，運用SPSS進(jìn)行顯著性分析，使用單因素方差分析(ANOVA)中Duncan進(jìn)行檢驗(P<0.05)，使用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-半胱氨酸鹽酸鹽對餅干pH與色度的影響

由圖1可知，餅干的pH隨L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量的增加呈下降趨勢，pH值從9.7下降至9.3，說明添加劑呈酸性能中和一部分面團中的堿。雖然餅干的pH值隨L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加有小幅降低，但數(shù)值依然在偏堿性范圍內(nèi)。

褐變是餅干在烘焙時的主要變化之一，不僅影響產(chǎn)品外觀，還影響口感風(fēng)味。研究[27]發(fā)現(xiàn)，L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加會使酥性餅干品質(zhì)變好。由圖2可知，餅干的L*值隨L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量的增加而增加，而a*值和b*值隨添加量的增加而下降。說明L-半胱氨酸鹽酸鹽的增加使餅干紅度和黃度下降，白度增加，即餅干在烘焙時呈更亮的顏色。L-半胱氨酸能與褐變產(chǎn)生的醌類反應(yīng)生成無色化合物[28]，所以添加L-半胱氨酸鹽酸鹽可以在一定程度上改善餅干的色澤。

2.2 L-半胱氨酸鹽酸鹽對HMF的影響

HMF是烘焙產(chǎn)品經(jīng)熱加工產(chǎn)生的主要有害物質(zhì)之一，常常用作焙烤食品的質(zhì)量指標(biāo)。模擬生理條件下，L-半胱氨酸可與HMF生成加合物從而消除HMF并降低HMF帶來的毒性[20]39-46。由圖3可知，L-半胱氨酸鹽酸鹽可降低餅干中HMF含量，當(dāng)添加量達(dá)0.3 g/kg后，HMF顯著下降，降低幅度達(dá)84.7%(P<0.05)。繼續(xù)增加L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加量，HMF降低緩慢，當(dāng)添加量達(dá)1.5 g/kg后，HMF下降94.3%。在組成蛋白質(zhì)的氨基酸中，L-半胱氨酸除了有氨基外還有一個巰基，更易與HMF發(fā)生Michael加成反應(yīng)[29]。所以添加L-半胱氨酸鹽酸鹽可顯著降低餅干中的HMF含量。

小寫字母不同代表樣品間存在顯著性差異(P<0.05)

小寫字母不同代表樣品間存在顯著性差異(P<0.05)

2.3 L-半胱氨酸鹽酸鹽對GO、MGO、3-DG的影響

二羰基化合物GO、MGO、3-DG等化學(xué)性質(zhì)非常活潑，可與蛋白質(zhì)反應(yīng)形成AGEs、丙烯酰胺、甲基咪唑等，危害人體健康，是熱加工食品中需要控制的有害物質(zhì)[30]。

由表2可知，餅干中會產(chǎn)生較多的3-DG和MGO，而L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加可顯著減少餅干中3-DG、GO和MGO的含量，并存在劑量依賴關(guān)系。當(dāng)L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加量為0.3 g/kg時，GO和MGO含量顯著下降，分別減少了82.0%和72.1%(P<0.05)，3-DG含量下降了13.7%。添加量增加至1.5 g/kg時，GO和MGO含量分別下降了89.6%和85.0%，3-DG含量雖然只下降了69%，但總量下降了704.2 mg/kg，說明L-半胱氨酸鹽酸鹽能有效清除餅干中GO、MGO和3-DG。

小寫字母不同代表樣品間存在顯著性差異(P<0.05)

表2 L-半胱氨酸鹽酸鹽對餅干中3-DG、GO、MGO的影響?

推測L-半胱氨酸鹽酸鹽降低二羰基化合物含量有兩種機制：① 美拉德反應(yīng)初期，半胱氨酸與Amadori產(chǎn)物反應(yīng)，阻止了Amadori產(chǎn)物的分子重排，抑制美拉德反應(yīng)，從而減少了二羰基化合物的產(chǎn)生[31]；② GO、MGO和3-DG等二羰基化合物形成后，半胱氨酸可與其形成加合物，從而降低其含量[21]。

2.4 L-半胱氨酸鹽酸鹽對熒光AGEs的影響

食品在高溫加工過程中，二羰基化合物會與蛋白質(zhì)上的一些氨基酸殘基如賴氨酸、精氨酸反應(yīng)形成AGEs，包括熒光和非熒光AGEs。熒光AGEs主要有乙二醛賴氨酸二聚體、丙酮醛賴氨酸二聚體、戊糖素、FFI、fluorolink、vesperlysineA-C等，非熒光AGEs主要有羧甲基賴氨酸、羧乙基賴氨酸等[32]。其中熒光AGEs常用于評價熱加工食品AGEs形成水平的指標(biāo)[33-34]。食品中的蛋白質(zhì)也會發(fā)生氧化，產(chǎn)生有害物質(zhì)并降低蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值。氧化過程中，蛋白質(zhì)色氨酸和酪氨酸殘基被修飾產(chǎn)生熒光產(chǎn)物，主要有二酪氨酸、犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸，其可作為蛋白質(zhì)氧化指標(biāo)[26]。因此，采用熒光法研究L-半胱氨酸鹽酸鹽對餅干中AGEs和蛋白質(zhì)氧化的影響。

由圖4可知，隨著L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量的增加，AGEs、二酪氨酸、犬尿氨酸和N-甲酰犬尿氨酸的熒光值均顯著下降，且呈明顯的量效關(guān)系。當(dāng)L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加量為0.3，0.6，1.0，1.5 g/kg時，熒光AGEs分別減少了8.9%，18.1%，25.5%，38.1%(P<0.05)。其作用機制可能是L-半胱氨酸鹽酸鹽抑制了AGEs的前體二羰基化合物的產(chǎn)生。L-半胱氨酸鹽酸鹽對蛋白質(zhì)氧化的抑制作用強于對熒光AGEs的抑制作用，當(dāng)添加量為1.5 g/kg時，二酪氨酸、犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸分別減少了53.0%，45.5%，51.4%(P<0.05)，接近甚至超過了半抑制率。其原因可能是L-半胱氨酸鹽酸鹽具有抗氧化活性，從而抑制了蛋白質(zhì)中氨基酸的氧化。

3 結(jié)論

L-半胱氨酸鹽酸鹽在改善餅干外觀的同時，還顯著抑制餅干中活潑羰基化合物(HMF、3-DG、GO、MGO)和熒光AGEs形成，同時抑制蛋白質(zhì)的氧化，且呈劑量效應(yīng)，說明L-半胱氨酸鹽酸鹽可應(yīng)用于餅干制作中來控制其主要內(nèi)源性化學(xué)污染物的產(chǎn)生。試驗也證實了活潑羰基化合物與L-半胱氨酸可形成加合物從而抑制AGEs的形成，且L-半胱氨酸鹽酸鹽對內(nèi)源性污染物具有高效的清除能力[21]。后續(xù)可進(jìn)一步探討L-半胱氨酸鹽酸鹽的作用機理以及其對焙烤食品風(fēng)味形成的影響，為L-半胱氨酸鹽酸鹽在焙烤食品中的應(yīng)用提供更多的科學(xué)依據(jù)。

小寫字母不同代表樣品間存在顯著性差異(P<0.05)