異硫氰酸熒光染色法在真菌性角膜炎診斷中的應(yīng)用觀察

真菌性角膜炎是我國(guó)常見的高致盲率的眼病, 部分患者需行角膜移植手術(shù)來(lái)保住眼球或獲得有用視力；然而全國(guó)僅有較少的醫(yī)院開展角膜移植手術(shù)，同時(shí)角膜來(lái)源有限，給真菌性角膜炎的治療帶了困難。如能在早期正確診斷真菌性角膜炎，并給予及時(shí)有效的抗真菌治療，部分患者可恢復(fù)一定有用視力，避免了角膜移植手術(shù)。因此，早期正確、高效的真菌病原學(xué)檢測(cè)，對(duì)真菌性角膜炎的預(yù)后有著十分重要的意義。我們?cè)?019年1～5月使用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC) 熒光染色法在真菌性角膜炎的診斷中取得良好的臨床效果，現(xiàn)報(bào)告如下。

資料與方法

一、一般資料

收集2019年1～5月在十堰市太和醫(yī)院眼科診斷為角膜炎，并通過角膜刮片行KOH涂片、革蘭染色及FITC熒光染色法檢查的42例(42只眼)患者的資料；其中住院患者治療40例，門診患者2例。其中男性33例，女性9例；年齡7～86歲，平均年齡(62.2±16.2)歲。

二、檢測(cè)方法

患者患眼采用愛爾凱因滴眼液表面麻醉,開瞼器開瞼，用無(wú)菌11號(hào)尖刀片刮取靠近潰瘍邊緣部位組織，在載玻片上均勻涂開。分別刮3個(gè)載玻片，1個(gè)送皮膚科行FITC熒光染色法檢測(cè)，另外2個(gè)分別送KOH涂片及革蘭染色檢查。

FITC熒光染色法：在涂有角膜病灶刮片物的載玻片上滴立特晰熒光液(FITC，安徽合肥華今生物科技有限公司)1滴，加蓋玻片，吸除多余的染色液(10 s)。將載玻片放置在萊卡DM 500熒光顯微鏡的水平操作臺(tái)上，先用低倍鏡找到樣本所在區(qū)，再用高倍鏡尋找菌絲或孢子等結(jié)構(gòu)，通常在1 min中內(nèi)完成。FITC熒光染色法檢測(cè)由皮膚科高級(jí)技師完成。

KOH涂片法：向涂有角膜病灶刮片物的載玻片上滴1滴10%KOH溶液，蓋上蓋玻片，酒精燈火焰上方稍加熱20～30 s將載玻片放置在奧林巴斯 CX21普通光學(xué)顯微鏡的水平操作臺(tái)上，先用低倍鏡找到樣本所在區(qū)，再用高倍鏡尋找菌絲或孢子等結(jié)構(gòu)。KOH濕片法檢查由檢驗(yàn)科高級(jí)技師完成。

革蘭染色法：(1)在涂有角膜病灶刮片物的載玻片上滴1滴脫色液(丙酮+95%乙醇，1:3)固定，自然揮發(fā)干燥。(2)加龍膽紫染色10 s,自來(lái)水沖洗，甩干。(3)加碘液染色10 s，自來(lái)水沖洗，甩干。(4) 加脫色液(丙酮+95%乙醇，1:3)10～20 s，自來(lái)水沖洗，甩干。(5)加沙黃溶液10 s，自來(lái)水沖洗。(6)以濾紙吸干。將染好的載玻片放置在奧林巴斯 CX21普通光學(xué)顯微鏡的水平操作臺(tái)上，先用低倍鏡找到樣本所在區(qū)，再用高倍鏡尋找菌絲、孢子或細(xì)菌等結(jié)構(gòu)。革蘭染色法檢查由檢驗(yàn)科高級(jí)技師完成。

真菌病原學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性：KOH涂片、革蘭染色涂片及FITC熒光染色法中任何1種為陽(yáng)性即為真菌病原學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性。

細(xì)菌病原學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性：KOH涂片或革蘭染色涂片中任何一種細(xì)菌檢測(cè)為陽(yáng)性即為細(xì)菌病原學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性。

三、病原學(xué)檢測(cè)陰性患者的臨床診斷

1.真菌性角膜炎：對(duì)于臨床表現(xiàn)符合真菌性角膜炎的患者，但真菌病原學(xué)檢測(cè)陰性者，行那他霉素眼水及特比奈芬眼水抗真菌治療，根據(jù)病情確定是否需聯(lián)合擴(kuò)瞳及普拉洛芬眼水。如臨床治療有效，臨床診斷為真菌性角膜炎。

2.病毒性角膜炎：真菌及細(xì)菌病原學(xué)檢測(cè)陰性，臨床特點(diǎn)符合病毒性角膜炎，使用更昔洛韋眼膠、貝復(fù)舒眼膠等眼藥治療有效者，臨床診斷為病毒性角膜炎。

3.細(xì)菌性角膜炎：真菌及細(xì)菌病原學(xué)檢測(cè)陰性，但懷疑細(xì)菌感染，懷疑革蘭陰性細(xì)菌者，使用可樂必妥聯(lián)合或不聯(lián)合頭孢唑林滴眼液；懷疑革蘭陰性細(xì)菌感染：使用可樂必妥滴眼液聯(lián)合頭孢他啶滴眼液，根據(jù)病情確定是否需聯(lián)合擴(kuò)瞳及非甾體滴眼液或激素滴眼液。臨床治療有效者，臨床診斷為細(xì)菌性角膜炎。臨床診斷患者，至少隨訪1個(gè)月。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用卡方檢驗(yàn)比較FITC熒光染色法與KOH涂片法聯(lián)合革蘭染色法的真菌檢出率，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

FITC熒光染色法在熒光顯微鏡下觀察到染呈亮綠色的真菌菌絲或孢子，背景呈黑色，與背景反差較大。其中菌絲表現(xiàn)為單根至大量不等的竹節(jié)樣結(jié)構(gòu)，周圍少許藍(lán)色光暈(圖1，2)；孢子表現(xiàn)為圓形、橢圓形結(jié)構(gòu)，周圍有少許藍(lán)色光暈(圖3)。細(xì)菌則不能顯示。KOH涂片法在白色背景中見空心的條狀菌絲(圖4)，孢子不易辨認(rèn)。革蘭染色下菌絲表現(xiàn)分紅色棒狀物(圖5)，孢子表現(xiàn)為圓形或橢圓形，胞核為藍(lán)色，胞質(zhì)為紅色(圖6)。

42例患者中FIFT熒光染色法檢出菌絲和或孢子共12例；KOH涂片和革蘭染色涂片共發(fā)現(xiàn)菌絲和或孢子7例。真菌病原學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性13例。另有1例植物外傷的患者，真菌病原學(xué)檢測(cè)陰性，但臨床表現(xiàn)與真菌性角膜炎相似，抗真菌治療后好轉(zhuǎn)，因此臨床考慮真菌性角膜炎。共診斷真菌性角膜炎14例，其中病原學(xué)診斷13例和臨床診斷1例。本研究中FITC熒光染色法在診斷真菌性角膜炎的檢出率為85.7%，高于KOH涂片法聯(lián)合革蘭染色法的50%，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

其余28例患者中KOH涂片和革蘭染色涂片共發(fā)現(xiàn)細(xì)菌15例，其中革蘭陽(yáng)性球菌7例、革蘭陰性桿菌5例及革蘭陽(yáng)性球菌合并革蘭陰性桿菌3例。其余13例患者中臨床診斷為病毒性角膜炎且抗病毒等對(duì)癥治療有效3例；剩余10例考慮為細(xì)菌性，其中8例抗感染治療后好轉(zhuǎn)，2例改善不明顯轉(zhuǎn)往上級(jí)醫(yī)院行進(jìn)一步治療。

討 論

目前真菌性角膜炎診斷常用方法有角膜刮片、真菌培養(yǎng)、共聚焦顯微鏡檢查及角膜組織病理檢查等。角膜刮片和真菌培養(yǎng)法作為傳統(tǒng)的真菌檢測(cè)方法，為目前真菌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)?；铙w共聚焦顯微鏡檢查作為一種無(wú)創(chuàng)性檢查，無(wú)需組織切片、固定及染色即可多層次立體地對(duì)角膜組織進(jìn)行實(shí)時(shí)成像，可對(duì)真菌性角膜炎疾病早期進(jìn)行診斷、明確感染深度、了解治療效果及確定停藥時(shí)間等[1]；同時(shí)對(duì)于真菌刮片及培養(yǎng)陰性的患者亦有較高的檢出率[2]。角膜共聚焦檢查要求患者良好的配合，避免因運(yùn)動(dòng)偽影而影響檢查結(jié)果；對(duì)于致密角膜浸潤(rùn)灶或角膜疤痕患者，其滲透性及可視性面臨巨大的挑戰(zhàn)。此外，對(duì)于非首診、已接受過診斷性治療或角膜刮片檢查可導(dǎo)致真菌菌絲被破壞而出現(xiàn)假陰性的結(jié)果[3]；同時(shí)該設(shè)備較為昂貴，需專業(yè)人員解讀結(jié)果。綜合以上因素，活體共聚焦顯微鏡在真菌性角膜炎診斷中的使用也受到了一定程度的限制。培養(yǎng)法可以鑒定菌種，但培養(yǎng)周期長(zhǎng)，一般需1～2周時(shí)間，陽(yáng)性率較低，不利于真菌性角膜炎的早期指導(dǎo)用藥。角膜病理檢查可鑒定菌種、進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，指導(dǎo)臨床用藥。但培養(yǎng)通常需切取一定量的角膜組織，對(duì)角膜有一定的創(chuàng)傷；同時(shí)費(fèi)用較高、耗時(shí)長(zhǎng)[4]，比較適合用于行角膜移植手術(shù)后對(duì)原角膜疾病的檢查，因而在未開展角膜移植手術(shù)的醫(yī)院開展較少。角膜刮片應(yīng)用最為廣泛，其中10%KOH涂片法雖然應(yīng)用最廣，具有診斷快、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì), 但其檢測(cè)結(jié)果符合率偏低, 存在一定的假陽(yáng)性結(jié)果, 容易造成誤診或漏診從而影響患者的臨床治療，同時(shí)對(duì)檢查者技術(shù)要求較高。陳薇嬰[4]報(bào)道真菌性角膜炎患者KOH涂片陽(yáng)性率為77.3%。革蘭染色法通常作為KOH涂片的補(bǔ)充檢查，可用于革蘭陽(yáng)性及陰性細(xì)菌的識(shí)別，真菌革蘭染色法陽(yáng)性率較低，同時(shí)革蘭染色涂片中隱球菌或白色念珠菌顯示為圓形、胞核為藍(lán)色，胞質(zhì)為紅色，與淋巴細(xì)胞較為相似，當(dāng)病原體量少時(shí)容易誤認(rèn)為淋巴細(xì)胞，或者少量淋巴細(xì)胞被誤診為真菌孢子。此外革蘭染色法相對(duì)操作較為復(fù)雜。但一項(xiàng)大型的臨床研究顯示共聚焦顯微鏡在真菌性角膜炎中的檢查率高達(dá)89%，但角膜涂片法診斷率高達(dá)96.5%[5]。蒲琪等[6]發(fā)現(xiàn)在31例非首診的真菌性角膜炎診斷中，真菌培養(yǎng)陽(yáng)性率為58%，角膜共聚焦的檢出率為19%。因此在非首診的可疑真菌性角膜炎的診斷中不應(yīng)過度重視角膜共聚焦檢查而忽略常規(guī)的角膜刮片及培養(yǎng)。真菌熒光染色法是指通過特殊熒光素標(biāo)聯(lián)幾丁質(zhì)酶，與真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)或纖維素產(chǎn)生特異性的結(jié)合，并吸收紫外光，使菌絲、孢子發(fā)出亮綠色熒光，在熒光顯微鏡下表現(xiàn)為亮綠色的真菌輪廓與黑暗背景，對(duì)比鮮明[7]。熒光染色劑Calcofluor White(CFW)在真菌性角膜炎中顯示出較高的檢出率[8]。劉先寧等[9]發(fā)現(xiàn)丫啶橙熒光染色法在真菌性角膜炎的可取得較高的檢出率。FITC是另一種易溶于水及酒精等溶劑中的黃色結(jié)晶粉末熒光染色劑。韓德忞等[10]將FITC熒光染色法用于真菌性皮屑及甲屑等真菌檢查，真菌檢出率高達(dá)97%，遠(yuǎn)高于KOH涂片法。徐艷等[7]的研究結(jié)果也支持這一研究結(jié)論。閻艷等[11]發(fā)現(xiàn)FITC熒光染色法在真菌性角膜炎患者切取的角膜標(biāo)本中的檢出率為97.4%。盡管上述兩研究顯示FITC熒光染色法在真菌組織的檢查率極高，但兩者病變組織的取材相對(duì)較多。張陽(yáng)等[12]在一項(xiàng)105例真菌性角膜炎的病例研究中發(fā)現(xiàn)角膜涂片的FITC熒光染色法診斷真菌感染的敏感性是97.0%，高于角膜共聚焦顯微鏡檢查(87.9%)、涂片吉姆薩染色(86.7%)及真菌培養(yǎng)(69.7%);同時(shí)FITC熒光染色法可以顯示阿米巴的包囊，但未檢出阿米巴滋養(yǎng)體，這與阿米巴包囊含有幾丁質(zhì)囊壁而滋養(yǎng)體不含有關(guān)。本研究中使用角膜刮片法送檢，取材量相對(duì)較少，但FITC熒光染色法真菌的檢出率仍高達(dá)85.7%，遠(yuǎn)高于本研究中KOH法聯(lián)合革蘭染色法的50%。本研究中KOH涂片法的真菌檢出率與Ferrer等[13]報(bào)道的 59.3%比較接近，但低于Gopinathan等[14]報(bào)道的91%，考慮與該研究中病例樣本量、刮片醫(yī)師技巧及檢驗(yàn)科技師診斷水平等原因有關(guān)。同時(shí)FITC熒光染色法中淋巴細(xì)胞不會(huì)顯示，念珠菌或白色念珠菌表現(xiàn)為黑色背景上的亮藍(lán)色；因此不易漏診，但隱球菌與白色念珠菌不易鑒別。但FITC熒光染色法也有一定的缺點(diǎn)，首先需要熒光顯微鏡；其次，需要較為昂貴的FITC試劑。再次，對(duì)于真菌性角膜炎合并有細(xì)菌感染的患者，單純的FITC熒光法可能出現(xiàn)漏診。最后，如果是感染灶僅位于角膜深基質(zhì)或內(nèi)皮面，角膜上皮完整、角膜淺基質(zhì)沒有病灶，基于角膜刮片的FITC熒光染色法將對(duì)臨床將無(wú)所幫助[15]。

FITC熒光染色法具有快速、高效的真菌檢出率，且操作簡(jiǎn)單，非常值得臨床推廣使用，同時(shí)FITC熒光法在非真菌性角膜炎有良好的排除診斷作用，建議將FITC熒光染色法作為可疑真菌性角膜炎的首選檢查方法。