龍葵生物堿對結(jié)腸癌DLD-1細胞增殖及凋亡的影響

周 曉，靳貝貝，樊東升，段秀俊，胥鵬鵬

（1.山西中醫(yī)藥大學，山西晉中030619； 2.山西中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，山西太原030006）

龍葵（Solanum nigrumL.），又名苦葵、苦菜、天茄子等，屬于一年乃至多年生的雙子葉茄科茄屬草本植物，分布廣泛，應(yīng)用歷史悠久，可追溯于《唐本草》。歷代醫(yī)書對龍葵功效的描述包括清熱解毒、活血化瘀、利水消腫、止咳祛痰；其性味歸經(jīng)則總結(jié)為性寒，味苦、微甘，有小毒，歸肺、腎經(jīng)。根據(jù)龍葵具體的功效，現(xiàn)代臨床多用于治療感冒發(fā)熱、咳嗽、牙痛、高血壓、慢性支氣管炎以及急性腎炎、泌尿系感染、細菌性痢疾、丙型肝炎病毒等細菌病毒感染類疾?。?］。近代研究發(fā)現(xiàn)龍葵對于腫瘤細胞、病毒以及細菌等微生物有較好的抑制作用，可用于抗腫瘤、抗菌和抗病毒的治療。此外，部分研究結(jié)果表示，龍葵還具有調(diào)節(jié)神經(jīng)和內(nèi)分泌的作用［2-5］。本研究采用體外細胞實驗的方法，用于觀察龍葵生物堿對人體結(jié)腸癌DLD-1細胞增殖及凋亡的影響，為龍葵的抗腫瘤作用提供實驗支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗藥物與細胞株 龍葵總生物堿：實驗室自制。對數(shù)生長期（細胞代謝活性強，數(shù)量呈對數(shù)生長）的結(jié)腸癌DLD-1細胞由山西醫(yī)科大學微生物與免疫實驗室提供。

1.1.2 實驗儀器 超聲波清洗機（SB-5200DTDN，寧波新芝生物科技有限公司），4℃/-20℃冰箱（BCD-568WDPF，海爾有限公司），超凈工作臺（SW-CJ-2D，蘇州凈化設(shè)備有限公司），細胞培養(yǎng)箱（DNP-9082，上海精宏有限公司），-80℃超低溫冰箱（DW-86L388A，海爾有限公司），全自動酶標儀（ELX808，Biotek），常溫低速離心機（Pico21，Thermo），水浴鍋（ThermoQ，杭州博日有限公司），流式細胞儀（Navios 10，美國Beckman Coulter公司），倒置熒光生物顯微鏡（A1，德國Zeiss公司），分析天平（Sartorious，德國賽多利斯公司）。

1.1.3 實驗試劑 90%乙醇（天津風船化學試劑），大孔樹脂LSA-10（171203，滄州寶恩化工有限公司），RPMI 1640培養(yǎng)基（BioReagent），PBS磷酸緩沖液 （Gibco），0.25%胰蛋白酶（1828S05，Amerso），青鏈霉素混合液（Gibco，201806），二甲基亞砜 DMSO（BioReagent，Sigma），新生牛血清（180910，杭州四季青生物工程材料有限公司），CCK-8（201708，美國 AMRESO 公司），Annexin VFITC/碘化丙啶（PI）細胞凋亡檢測試劑盒（20180126，江蘇凱基生物技術(shù)股份公司），AO-EB雙染試劑盒（Gibco）。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制 龍葵生物堿藥液：精密稱取龍葵生物堿提取物適量，加二甲基亞砜（DMSO）適量（最終含量控制在0.6%以下［6］），超聲作用溶解，加入完全培養(yǎng)基，將其配置成濃度為2 mg/mL的龍葵生物堿溶液，用0.22 μm的微孔濾膜濾過，120℃熱壓滅菌后，于4℃保存，使用時稀釋至所需濃度，即得。顯色液：將AO和EB兩種溶液按1∶1比例混合即可。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 取結(jié)腸癌DLD-1細胞進行傳代培養(yǎng)，用PBS磷酸緩沖液緩慢沖洗細胞表面，移除PBS，加入0.25%胰蛋白酶溶液置于細胞培養(yǎng)箱中消化3 min，后加入RPMI 1640培養(yǎng)基終止消化，并將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，采用1000 r/min的速率離心5 min，棄去上清液，吸取沉淀物并加入含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的1640培養(yǎng)基混懸細胞，放置于37℃含有5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至完全貼壁，即可。

1.2.3 CCK-8法考察對細胞增殖的影響 取“1.2.2”項下制備的細胞混懸液，以吸管吹打均勻，按照每孔500個細胞接種到96孔板，每孔體積100 μL，將 96孔板放置于 37 ℃、含有 5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞完全貼壁后進行分組。分為給藥組（0.6 mg/mL，0.8 mg/mL，1.0 mg/mL，1.2mg/mL，1.4 mg/mL 5個濃度梯度的生物堿溶液）與空白對照組（含10%血清的培養(yǎng)基）。每組3個復(fù)孔，每孔 100 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，移除 96孔板中的溶液，在每孔內(nèi)加入含10%CCK-8的RPMI 1640培養(yǎng)基溶液100 μL，放置細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h，取出，終止培養(yǎng)，使用酶標儀于450 nm波長下測吸光度，記錄各孔的OD值，并計算各組的細胞增殖抑制率。抑制率=（1-給藥組的OD值/空白對照組的OD值）×100%。

1.2.4 AO-EB雙染色熒光顯色法觀察細胞形態(tài) 取“1.2.2”項下制備的細胞混懸液，采用顯微鏡計數(shù)法將細胞濃度調(diào)整為5×105個/mL，將其置于6孔板中，每孔加入2 mL的RPMI 1640培養(yǎng)基后，將6孔板放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁生長至約80%左右時移除培養(yǎng)基，在孔內(nèi)分別加入濃度為 0.6 mg/mL、1.0 mg/mL、1.4 mg/mL 的龍葵生物堿溶液，而空白對照組加入RPMI 1640培養(yǎng)基溶液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，移除培養(yǎng)基，使用PBS磷酸緩沖液沖洗2次，后每孔中加入2 mL新鮮PBS溶液，避光加入事先配好的顯色液40 μL，室溫放置 2～5 min，置熒光顯微鏡下觀察，并拍照［7］。

1.2.5 流式細胞法考察對細胞凋亡的影響 取“1.2.2”項下制備的細胞混懸液，置于37℃、含有5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁完全后分為 4組，給藥組 3組（0.6 mg/mL，1.0 mg/mL，1.4mg/mL）與空白對照組（含10%血清的培養(yǎng)基）。待細胞給藥24 h后，使用PBS溶液沖洗1次，加胰蛋白酶消化細胞5 min，放入低速離心機以1000 r/min的速率離心5 min。棄去上清液，將沉淀物制成細胞濃度為（2～5）×105個/mL的細胞懸液。再加入100 μL的Binding Buffer重懸細胞，并加入5 μL的Annexin V-FITC 和5 μL的 PI Staining Solution混合均勻，室溫條件下避光孵育15 min。之后加入200 μL 的 Binding Buffer，搖勻，流式細胞儀檢測［8］。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0軟件包進行分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 龍葵生物堿對DLD-1細胞增殖的影響

各濃度龍葵生物堿對結(jié)腸癌DLD-1細胞均有抑制作用，隨著給藥濃度的增大，細胞抑制率隨之增強，IC50值為0.94 mg/mL。龍葵生物堿不同濃度組與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 龍葵生物堿對DLD-1腫瘤細胞增殖的抑制作用 （x ±s）

2.2 龍葵生物堿對DLD-1細胞形態(tài)的影響

空白對照組細胞形態(tài)飽滿，數(shù)量較多；各給藥組大部分細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，呈現(xiàn)不同程度的固縮狀，變圓且體積縮小，且數(shù)量有所減少。結(jié)果見圖1。

圖1 龍葵生物堿對細胞形態(tài)的影響

2.3 龍葵生物堿對DLD-1細胞凋亡的影響

各給藥組凋亡細胞數(shù)隨著龍葵生物堿質(zhì)量濃度的升高，凋亡率逐漸上升，表明龍葵生物堿呈濃度依賴性誘導(dǎo)DLD-1細胞凋亡。結(jié)果見圖2。

圖2 龍葵生物堿對細胞凋亡的影響

3 討論

結(jié)腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化道惡性腫瘤，屬于第三大胃腸道腫瘤，全球每年有近50萬人死于此病。美國腫瘤協(xié)會調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，結(jié)腸癌的發(fā)病率以及死亡率排在各類腫瘤的前列，2016年約數(shù)十萬例患者因結(jié)腸癌離世［9］。由于結(jié)腸癌的高發(fā)病率與高死亡率，近年來，醫(yī)學工作者對結(jié)腸癌的預(yù)防與治療進行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)運用中醫(yī)藥治療結(jié)腸癌，其有效成分可在一定程度上對結(jié)腸癌細胞生長和癌細胞轉(zhuǎn)移產(chǎn)生抑制作用，并對患者自身免疫力產(chǎn)生較為有效的積極作用，這使得腫瘤細胞凋亡速率增快，進一步抑制了腫瘤基因的表達。但對于中藥治療結(jié)腸癌的具體分子機制仍不夠明確，有待進一步探索，以便更加準確有效地應(yīng)用于腫瘤的預(yù)防和治療［10-11］。

龍葵作為我國傳統(tǒng)的中藥，作用廣泛，效果明顯，應(yīng)用可追溯到《唐本草》，而近代大量醫(yī)學實驗研究也證實了龍葵中含有豐富的生物堿、皂苷等大量的可用于癌癥治療的有效成分，可用于乳腺癌、肝癌、宮頸癌、肺癌、卵巢癌、胃癌等多種惡性腫瘤的治療。

CCK-8結(jié)果顯示，龍葵生物堿對結(jié)腸癌DLD-1細胞有抑制增殖的作用，且在一定給藥范圍內(nèi)隨龍葵生物堿濃度的增加，抑制效果增強，在給藥濃度為1.4 mg/mL時，細胞增殖抑制率可達（77.87±0.39）%，細胞的半數(shù)抑制濃度為0.94 mg/mL。AO-EB與細胞凋亡實驗結(jié)果顯示，龍葵生物堿可誘導(dǎo)DLD-1細胞凋亡，細胞形態(tài)與數(shù)量發(fā)生改變，且細胞凋亡率隨著龍葵生物堿濃度的升高而增大。綜上所述，在一定劑量范圍內(nèi)，龍葵生物堿對DLD-1細胞的增殖產(chǎn)生影響，但其作用機制仍需進一步研究。