鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在糖尿病雄性大鼠性腺組織中的表達(dá)

劉文嬌 馬 婧 韓瑞鈺 王樹松,

1河北師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院（河北石家莊 050021）；2．河北省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院，國家衛(wèi)生和健康委員會(huì)計(jì)劃生育與優(yōu)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北省生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（河北石家莊 050071）

鋅是人類機(jī)體生長發(fā)育必需的微量元素之一，是人體內(nèi)300多種酶和轉(zhuǎn)錄因子的重要組成成分，直接參與核酸和蛋白質(zhì)的合成、細(xì)胞的分化和增殖以及許多重要的代謝，在生殖系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用，缺鋅導(dǎo)致男（雄）性生育力下降。研究表明，鋅穩(wěn)態(tài)的精確控制對(duì)于維持機(jī)體健康和預(yù)防疾病至關(guān)重要，糖尿病患者體內(nèi)存在鋅穩(wěn)態(tài)失衡[1]。鋅離子的平衡主要由鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZnTs家族和Zips家族兩個(gè)家族完成的，前者能將鋅離子由胞質(zhì)中轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)外，后者則將鋅離子由胞質(zhì)外轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)中[2]。因此，本文觀察了糖尿病雄性大鼠生殖性腺中鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的變化，闡明鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在糖尿病雄性生殖系統(tǒng)中的作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)方法

（一）動(dòng)物模型構(gòu)建及分組

6周齡健康雄性SD大鼠20只，隨機(jī)分為對(duì)照組和糖尿病（DM）組，對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)并于8周后一次性注射0.2mL枸櫞酸鈉緩沖液；DM組給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，8周后一次性腹腔注射30mg·kg-1鏈脲佐菌素，1周后以空腹血糖大于11.7mmol/L視為造模成功，于造模后處死并留取性腺組織，性腺組織一半置于10%福爾馬林液中固定，剩余組織立即放入液氮中，然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存待用。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

（二）大鼠精子濃度和活力的檢測

取新鮮大鼠左側(cè)附睪尾部，置于裝有生理鹽水的EP管中，用眼科剪充分剪碎，37℃孵育10min，使精子充分溢出，取10μl置入精子計(jì)數(shù)板中，記錄精子濃度和活力。

（三）HE 染色

大鼠睪丸、附睪、精囊、前列腺等組織在10%福爾馬林中固定24h后，常規(guī)石蠟包埋，切片。常規(guī)脫蠟復(fù)水；蘇木素染色6min，自來水沖洗，鹽酸酒精分化3s，自來水沖洗，0.1%氨水返藍(lán)3s，自來水沖洗，伊紅染色8min，自來水沖洗；脫水脫蠟：100%酒精Ⅰ、Ⅱ各5min，脫蠟劑Ⅰ、Ⅱ各5min，中性樹膠封片。

（四）免疫組織化學(xué)

常規(guī)脫蠟復(fù)水。PBS洗3次，每次5min。檸檬酸鈉-EDTA抗原修復(fù)，室溫自然冷卻，PBS洗3次，每次5min。3%過氧化氫孵育40min，PBS洗3次，每次5min。山羊血清封閉1h。滴加一抗（其中對(duì)照用1×PBS，ZnT1和ZnT8以 1：100比例稀釋，Zip1以 1:200的比例稀釋，Zip2以1:400的比例稀釋），4℃過夜。PBS洗滌3次，滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗工作液，室溫孵育1h，PBS洗滌3次，滴加辣根酶工作液并室溫孵育30min，PBS洗滌3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。陽性染色為棕黃色。

（五）實(shí)時(shí)定量PCR檢測

用RNA提取試劑盒（ZP404，北京莊盟國際）分別提取睪丸、附睪、精囊、前列腺等組織的總RNA，按照說明書逆轉(zhuǎn)為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增ZnT1、ZnT8、Zip1和Zip2。PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性 3min，95℃30s、62℃30s、72℃30s，共35個(gè)循環(huán)，在72℃30s處收集熒光信號(hào)，72℃延伸5min。分別以正常大鼠組織為1倍目的基因表達(dá)量的校準(zhǔn)樣品，根據(jù)2-△△ct計(jì)算糖尿病組大鼠組織中各目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)

β-actin 引 物 序 列 ：5′-ACCCGCGAGTACAACCTTCT-3′，5′-GATGCCTCTCTTGCTCTGGG-3′;

ZnT1 引物序列：5′-GCAGAGAAGGCTCCAACA GT-3′,5′-ATTCGGGCTGTTTGTTTGGC-3，;

ZnT8 引物序列：5′-GCACTGATGTAGGACGCA CT-3′，5′-CAGGCTTCTGTCCACGTTCT-3′;

Zip1 引物序列 ：5′-GCCTTGGAGGCTCTTCATGT-3′，5′-AAGCCAGTGTGATCTGCTCC-3′;

Zip2 引 物 序 列 ：5，-CTGCATCCGTCTGGAACCAT-3′，5′-ATGGTTCCAGACGGATGCAG-3′;

（六）Western Blot

稱取性腺組織0.1g，每管加入裂解液500μl。超聲裂解5min。低溫離心取上清，用BCA試劑盒（PQ0012，杭州聯(lián)科生物）測蛋白濃度。凝膠電泳，80V恒壓30min左右，待電泳至濃縮膠底部時(shí)，將電壓轉(zhuǎn)置120V，電泳約60min。恒流200mA電泳轉(zhuǎn)膜1.5h。5%脫脂奶粉封閉1.5h。一抗孵育（其中ZnT1、ZnT8、Zip1和Zip2以1:1000的比例稀釋，內(nèi)參β-actin以1:10000的比例稀釋）4℃過夜。用1×TBST溶液膜洗3次，每次10min。二抗（以1:8000的比例稀釋）搖床孵育1.5h。1×TBST洗兩次，1×TBS洗1次，每次洗10min。ECL化學(xué)發(fā)光液顯影，采用Image J軟件分析目的條帶的灰度值和內(nèi)參條帶的灰度值。

二、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS21.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，符合正態(tài)分布進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、大鼠一般情況

第9周時(shí)，糖尿病組10只大鼠中7只大鼠空腹血糖＞11.7mmol/L，造模成功率為70%。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，糖尿病組大鼠體重、空腹血糖(Fasting Blood Glucose,FBG)，甘油三酯(Triglyceride,TC)，總膽固醇（Total cholesterol,TC），低密度脂蛋白膽固醇 （Low Density Liporotein Cholesterol,LDL-C)均顯著高于對(duì)照組，高密度脂蛋白膽固醇 （High Density Lippoorotein Cholesterol,HDL-C）顯著低于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。糖尿病組大鼠精子濃度和精子活力顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表1 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)兩組大鼠血糖血脂、精子參數(shù)的情況（x±s）

二、兩組大鼠睪丸、附睪、精囊、前列腺等組織的HE染色（見圖1）

睪丸：對(duì)照組大鼠睪丸生精小管內(nèi)的不同種類的細(xì)胞有序排列，結(jié)構(gòu)比較完整，有大量精子存在。糖尿病組大鼠睪丸中的生精小管內(nèi)，有些間質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，組織中間出現(xiàn)空泡現(xiàn)象，精子數(shù)量減少。

附睪：對(duì)照組大鼠附睪管內(nèi)均勻分布大量精子，并無規(guī)則地排列著，染色較深，同時(shí)組織細(xì)胞內(nèi)的核和胞質(zhì)清晰可見。糖尿病組大鼠附睪內(nèi)精子數(shù)量明顯減少，在附睪上皮細(xì)胞出現(xiàn)了空泡樣的變化以及部分主細(xì)胞的胞核發(fā)生溶解破裂的現(xiàn)象。

精囊：對(duì)照組大鼠精囊腺腔內(nèi)含有嗜伊紅分泌物，腺腔內(nèi)有許多褶皺。糖尿病大鼠精囊腺腔內(nèi)褶皺減少。

前列腺：對(duì)照組大鼠前列腺為薄上皮、內(nèi)壁光滑，胞質(zhì)染色較深并且比較完整。糖尿病組大鼠前列腺內(nèi)壁褶皺增多，上皮增生，疏松結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

圖1 兩組大鼠睪丸、附睪、精囊、前列腺組織的HE染色（標(biāo)尺=20μm）

三、免疫組織化學(xué)分析鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在兩組大鼠性腺組織中的定位和表達(dá)（見圖2）

睪丸：在大鼠睪丸中ZnT1在質(zhì)膜、間質(zhì)細(xì)胞以及生精細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，糖尿組明顯低于對(duì)照組；ZnT8在睪丸間質(zhì)細(xì)胞和生精細(xì)胞胞質(zhì)中均有表達(dá)，糖尿病組明顯高于對(duì)照組；Zip1和Zip2在睪丸生精細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，糖尿病組明顯低于對(duì)照組。

附睪：ZnT1和Zip1表達(dá)在附睪腔內(nèi)細(xì)胞質(zhì)中，糖尿病組高于對(duì)照組；ZnT8表達(dá)在附睪管內(nèi)上皮細(xì)胞、附睪上皮基底部細(xì)胞以及腔內(nèi)胞質(zhì)中，糖尿病組高于對(duì)照組；Zip2表達(dá)在附睪管頂細(xì)胞以及腔內(nèi)胞質(zhì)中，糖尿病組低于對(duì)照組。

精囊：ZnT1、ZnT8、Zip1 和 Zip2 均在大鼠精囊腺上皮細(xì)胞的胞漿和胞膜上表達(dá)。糖尿病組ZnT1、Zip1表達(dá)明顯低于對(duì)照組，ZnT8兩組之間表達(dá)相反，Zip2在兩組表達(dá)相近。

前列腺：ZnT1、ZnT8、Zip1 和 Zip2 在大鼠前列腺中表達(dá)在前列腺上皮細(xì)胞的胞漿與胞膜中，糖尿病組較對(duì)照組表達(dá)均稍高。

圖2 免疫組織化學(xué)法檢測ZnT1、ZnT8、Zip1、Zip2在兩組大鼠睪丸、附睪、精囊、前列腺組織中的表達(dá)（標(biāo)尺=20μm）

四、Western blot檢測鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在兩組大鼠性腺組織中的蛋白水平表達(dá)（見圖3）

圖3 兩組大鼠性腺組織Znt1、Znt8和Zip1和Zip2蛋白表達(dá)情況

ZnT1：在糖尿病組睪丸和精囊中表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組 （P<0.05），在附睪中表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。

ZnT8：在糖尿病組睪丸、附睪、精囊和前列腺組織中均高于對(duì)照組（P<0.05）。

Zip1：在糖尿病組睪丸和精囊組織中低于對(duì)照組（P<0.05），在附睪中表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P<0.05），在前列腺中未見明顯差異（P>0.05）。

Zip2：在糖尿病組附睪中明顯低于對(duì)照組（P<0.05），其它組織中未見明顯差異。

五、RT-PCR分析鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在兩組大鼠睪丸、附睪、精囊、前列腺等組織中mRNA表達(dá)（見圖4）

圖4 兩組大鼠性腺組織Znt1、Znt8和Zip1和Zip2 mRNA的表達(dá)

ZnT1：糖尿病組大鼠睪丸、精囊中ZnT1 mRNA的表達(dá)較對(duì)照組下降，在附睪、前列腺中升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

ZnT8：糖尿病組大鼠睪丸、附睪、精囊、前列腺中ZnT8 mRNA的表達(dá)較對(duì)照組增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

Zip1：糖尿病組大鼠睪丸和精囊中Zip1 mRNA的表達(dá)較對(duì)照組明顯降低（P<0.05），附睪和前列腺中表達(dá)較對(duì)照組明顯升高（P<0.05）。

Zip2：糖尿病組大鼠附睪Zip2 mRNA的表達(dá)較對(duì)照組明顯降低（P<0.05），前列腺組織明顯升高（P<0.05）。

表2 兩組大鼠性腺組織Znt1、Znt8和Zip1和Zip2蛋白和mRNA表達(dá)變化趨勢匯總（與對(duì)照組相比，P<0.05）

討 論

鋅是人類必需的微量元素之一，鋅與人體內(nèi)近300種酶的活性有關(guān)，廣泛參與核酸和蛋白質(zhì)的代謝，因此也影響到各種細(xì)胞的生長、分裂和分化。缺鋅可產(chǎn)生多種疾病。糖尿病是由環(huán)境因素、遺傳因素共同作用引起的、以慢性高血糖為特征的代謝紊亂性疾病，低鋅血癥是糖尿病患者的普遍癥狀[3]。鋅離子的穩(wěn)態(tài)是由鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白精密調(diào)控，鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體的正常分布對(duì)睪丸組織的保護(hù)起著重要作用，保證了鋅在各種細(xì)胞中的合理分配，使鋅發(fā)揮其正常的生理功能[4]。鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)改變不僅可能干擾細(xì)胞器中鋅的穩(wěn)態(tài)，還可能導(dǎo)致細(xì)胞器功能障礙，鋅穩(wěn)態(tài)失衡涉及人類疾病的發(fā)病機(jī)理[5,6]。

ZnT1是ZnT家族中最先被發(fā)現(xiàn)的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體，是一種細(xì)胞膜蛋白，它能夠?qū)n2+從細(xì)胞漿中轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，降低細(xì)胞漿內(nèi)Zn2+的濃度，從而維持細(xì)胞內(nèi)適宜的鋅水平[7,8]。ZnT1還具有抑制鋅通過L型鈣通道內(nèi)流的功能。Elgazar等[9]發(fā)現(xiàn)ZnT1存在于質(zhì)膜中，同時(shí)存在于支持細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。本研究顯示，ZnT1在大鼠睪丸、精囊、附睪和前列腺組織中均有表達(dá)，糖尿病組大鼠睪丸和精囊中表達(dá)明顯降低，附睪中表達(dá)明顯增高。

ZnT8是ZnT家族的一個(gè)成員，ZnT8是一種特異存在于胰島β細(xì)胞的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體，其功能為向胰島β細(xì)胞的胰島素分泌小泡內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)鋅離子，對(duì)于胰島素的貯存和分泌十分重要?；A(chǔ)研究表明ZnT8能刺激胰島素分泌，造成電壓敏感性鈣離子通道開放，導(dǎo)致鈣離子流出和鈣離子含量增加[10]。研究證實(shí)ZnT8在睪丸組織中也有表達(dá)，其功能可能與睪酮合成有關(guān)[11]。Zhang等[12]研究表明ZnT8存在于人和小鼠的睪丸間質(zhì)細(xì)胞中，ZnT8基因敲除的小鼠血清睪酮水平遠(yuǎn)低于正常小鼠，表明ZnT8在睪酮生物合成中起到關(guān)鍵作用，還證實(shí)ZnT8通過影響蛋白激酶A（PKA）信號(hào)通路進(jìn)而影響線粒體中的鋅含量。本研究發(fā)現(xiàn)ZnT8蛋白和ZnT8 mRNA在大鼠睪丸、附睪、精囊和前列腺組織中均有表達(dá)，糖尿病組大鼠睪丸、附睪、精囊和前列腺組織中ZnT8表達(dá)均明顯升高。結(jié)果說明，糖尿病對(duì)雄性大鼠各性腺及附性腺組織中ZnT8的影響是相同的，促進(jìn)Zn2+從細(xì)胞漿中轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，降低細(xì)胞漿內(nèi)Zn2+的濃度。

鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZIP家族(SLC39)是一類介導(dǎo)鋅攝入的跨膜蛋白,目前已在人體中發(fā)現(xiàn)14個(gè)成員(ZIP1～14)。ZIP1和Zip2位于細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞漿游離鋅缺乏時(shí)，ZIP1、Zip2從細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)鋅離子進(jìn)入細(xì)胞漿，以維持細(xì)胞的鋅穩(wěn)態(tài)。有研究表明Zip1和Zip2在相同的細(xì)胞類型中共存，它們之間還能相互作用形成異質(zhì)多聚體[13]。Franz等[14]認(rèn)為Zip2是一種促進(jìn)的二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以通過細(xì)胞外pH和膜電位調(diào)節(jié)，并且H+介導(dǎo)的調(diào)節(jié)機(jī)制可能對(duì)確定運(yùn)輸速度和方向具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，Zip1和Zip2在雄性大鼠性腺組織中均有表達(dá)；糖尿病大鼠Zip1和Zip2 mRNA在前列腺組織中均顯著升高，Zip1mRNA、Zip1蛋白在糖尿病大鼠睪丸和精囊組織中呈現(xiàn)下調(diào)，在附睪中表達(dá)上調(diào)；Zip2 mRNA、Zip2蛋白在糖尿病大鼠附睪組織中呈現(xiàn)下調(diào)，Zip2蛋白在精囊中上調(diào)、Zip2 mRNA在糖尿病大鼠前列腺組織中呈現(xiàn)上調(diào)。

Foster等[15]研究認(rèn)為鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA的相對(duì)表達(dá) 變 化 很 大 ，ZnT1、Zip1 表 達(dá) 最 豐 富 ，ZnT1 和Zip1mRNA彼此呈高度正相關(guān)關(guān)系，其在跨越質(zhì)膜的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)中具有相互作用。本研究結(jié)果顯示，ZnT1和Zip1mRNA和蛋白表達(dá)在雄性性腺組織中變化趨勢也具有一致性，ZnT1和Zip1之間的相關(guān)性表明這兩種鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有高度協(xié)調(diào)作用。

綜上所述，在雄性大鼠生殖性腺中ZnT1、ZnT8和Zip1、Zip2mRNA和蛋白都均有表達(dá)，這4個(gè)抗體的免疫組織化學(xué)也都具表達(dá)。ZnT1、ZnT8和Zip1、Zip2在糖尿病大鼠性腺中表達(dá)發(fā)生了變化，反映了組織內(nèi)鋅穩(wěn)態(tài)的失衡，鋅代謝紊亂對(duì)雄性大鼠生育力受損起到重要的作用。