表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)在核酸檢測(cè)中的研究進(jìn)展及應(yīng)用

田暉艷，劉 羽，黃姣祺，謝鳳欣，黃國(guó)榮，廖 璞，府偉靈，張 陽

1. 陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 4000382. 重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400030

1 拉曼光譜技術(shù)及其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

1928年印度科學(xué)家Raman首次發(fā)現(xiàn)拉曼散射效應(yīng)，該效應(yīng)產(chǎn)生的拉曼光譜是一種散射光譜，當(dāng)單色光束的光子與生物分子相互作用時(shí)，可發(fā)生彈性碰撞及非彈性碰撞； 其中，彈性碰撞所產(chǎn)生的光散射被稱為瑞利散射，該碰撞過程僅改變了光子的運(yùn)動(dòng)方向而不改變頻率； 而在非彈性碰撞過程中，光子與分子之間發(fā)生能量交換，光子的運(yùn)動(dòng)方向及頻率均發(fā)生改變，這種非彈性散射稱為拉曼散射。拉曼散射光譜反應(yīng)了特征峰的數(shù)量、強(qiáng)度、峰寬和位移等信息，這些豐富的譜峰信息均與待測(cè)物質(zhì)的分子振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)密切相關(guān)，因此，每種物質(zhì)都有其特征拉曼光譜，通過檢測(cè)得到的拉曼光譜與數(shù)據(jù)庫(kù)中的拉曼光譜進(jìn)行比對(duì)，便可得到待測(cè)物質(zhì)的組成信息,從而達(dá)到定性分析的目的。此外，利用拉曼特征峰強(qiáng)度與待測(cè)物質(zhì)濃度成正比的關(guān)系，可以達(dá)到半定量分析的目的。

核酸是以核苷酸為合成單位形成的生物大分子化合物，是生命最基本的遺傳物質(zhì)，在生命體生長(zhǎng)、遺傳、進(jìn)化等一系列重大生命現(xiàn)象中占據(jù)著決定性作用。開展核酸分子診斷對(duì)促進(jìn)人類健康醫(yī)療的發(fā)展具有重要意義。拉曼光譜技術(shù)在核酸等生物樣本的檢測(cè)與分析方面具有獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)： (1)對(duì)待測(cè)樣本的形狀、大小要求低，可以省去復(fù)雜的樣本預(yù)處理環(huán)節(jié)； (2)樣本需求量少，適用于微量及痕量樣本的檢測(cè)； (3)可實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，一般在30 s內(nèi)即可完成對(duì)一個(gè)樣本的檢測(cè)； (4)通過拉曼標(biāo)簽技術(shù)的引入可以達(dá)到強(qiáng)特異性檢測(cè)的目的； (5)由于水的拉曼散射很微弱，使得拉曼光譜技術(shù)非常適用于水環(huán)境中樣本的檢測(cè)。因此，SERS光譜非常適合于多元生物樣本的檢測(cè)。

2 表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)(SERS)

2.1 表面增強(qiáng)拉曼散射光譜的發(fā)現(xiàn)

拉曼光譜作為一種無損、非接觸式且可重復(fù)的快速檢測(cè)技術(shù)，能夠提供分子結(jié)構(gòu)振動(dòng)的指紋圖譜信息且譜峰窄不易發(fā)生重疊，在生化物質(zhì)檢測(cè)中具有顯著優(yōu)勢(shì)。但拉曼光譜因其散射截面只有10～30 cm2/分子(約為紅外的10-6，熒光光譜的10-14)且容易受到熒光干擾[1]，限制了拉曼光譜的廣泛應(yīng)用。20世紀(jì)70年代，F(xiàn)leischmann小組研究發(fā)現(xiàn)，將吡啶吸附在粗糙的銀表面時(shí)，可獲得高強(qiáng)度的拉曼光譜信號(hào)[2]。在隨后的研究中，Van Duyne及Creighton等證實(shí)了粗糙銀表面對(duì)吡啶分子的拉曼信號(hào)放大程度可達(dá)105～106倍，并將這一粗糙金屬表面的增強(qiáng)效應(yīng)命名為表面增強(qiáng)拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering,SERS)[3]。20世紀(jì)末，Nie小組及Kneipp等先后研究報(bào)道了SERS在單分子及單納米粒子中的檢測(cè)，其拉曼信號(hào)增強(qiáng)因子可達(dá)1014 [4-5]。

2.2 SERS增強(qiáng)原理

在眾多的SERS增強(qiáng)機(jī)理研究中，物理增強(qiáng)機(jī)理和化學(xué)增強(qiáng)機(jī)理是目前被普遍接受的兩種解釋機(jī)理(如圖1所示)。其中，物理增強(qiáng)又稱為電磁場(chǎng)增強(qiáng)(electromagnetic enhancement,EM)，即電磁波與比波長(zhǎng)小得多的等離子體(如Au、Ag)納米結(jié)構(gòu)的相互作用會(huì)引起金屬表面自由電子的集體振蕩； 當(dāng)入射光的頻率與金屬中自由電子固有的振蕩頻率相匹配時(shí)，局域表面等離激元共振(LSPR)就會(huì)發(fā)生，從而導(dǎo)致入射光場(chǎng)的增強(qiáng)，研究表明電磁場(chǎng)增強(qiáng)的增強(qiáng)因子可達(dá)1011左右[6]?；瘜W(xué)增強(qiáng)(chemical enhancement)是一種電荷轉(zhuǎn)移增強(qiáng)[7]，需要分析物直接吸附或通過化學(xué)鍵結(jié)合在粗糙金屬表面，并與金屬表面存在電荷轉(zhuǎn)移，當(dāng)入射光子的能量與電子在金屬基底及吸附物之間的轉(zhuǎn)移能量差相等時(shí)將產(chǎn)生共振，從而使體系的有效極化率增加并使拉曼信號(hào)增強(qiáng)，研究表明化學(xué)增強(qiáng)因子為101～103左右[8]。通常認(rèn)為SERS效應(yīng)的產(chǎn)生是由上述兩種增強(qiáng)機(jī)理共同作用的結(jié)果。此外，Michaels小組研究發(fā)現(xiàn)在金屬納米結(jié)構(gòu)的連接點(diǎn)及空隙處，SERS增強(qiáng)因子最大，這是因?yàn)楫?dāng)金屬納米顆粒相互靠近形成聚集時(shí)躍遷偶極分子相互耦合，在顆粒的結(jié)合處能獲得顯著增強(qiáng)的SERS效應(yīng)[9]，這些特殊的增強(qiáng)位點(diǎn)被稱為SERS“熱點(diǎn)”。目前，大量對(duì)SERS金屬基底的選擇研究顯示，Au、Ag納米結(jié)構(gòu)因具備較好的穩(wěn)定性、重復(fù)性且極易制取，成為研究者們對(duì)SERS基底的首選，并且，具備各向異性及尖銳形態(tài)的納米顆粒(如錐形、納米棒、納米星等)較對(duì)稱形(如球形)納米顆粒的SERS增強(qiáng)效果更好[10]。

圖1 SERS原理示意圖

3 基于SERS的核酸檢測(cè)技術(shù)類型及應(yīng)用

核酸的特異性檢測(cè)是臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容，在疾病的診斷及治療方面具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。常見的基于SERS的核酸檢測(cè)技術(shù)，根據(jù)是否使用探針標(biāo)記物，可分為無標(biāo)記檢測(cè)(Label-free SERS)及標(biāo)記型檢測(cè)(SERS tags)兩種類型(如圖2所示)。

圖2 SERS無標(biāo)記檢測(cè)(左)及標(biāo)記型檢測(cè)(右)技術(shù)原理示意圖

3.1 無標(biāo)記檢測(cè)

在無標(biāo)記檢測(cè)方法中，待測(cè)樣本直接吸附于金屬納米結(jié)構(gòu)表面，利用SERS技術(shù)直接獲取生物樣本自身的拉曼指紋圖譜，該方法需要結(jié)合特殊的納米基底結(jié)構(gòu)及光譜分析技術(shù)，用于區(qū)分不同狀態(tài)下的生物分子或不同物種的細(xì)胞、微生物的光譜信息[11]； ElSayed等利用高濃度的球形納米銀膠體顆粒聚集后形成的SERS“熱點(diǎn)”效應(yīng)，研究了癌細(xì)胞DNA發(fā)生構(gòu)想變化而形成的拉曼特征峰，實(shí)現(xiàn)了對(duì)癌細(xì)胞DNA和健康細(xì)胞DNA高重現(xiàn)性的分辨[12]。Abell等設(shè)計(jì)了一種以Ag納米棒為結(jié)構(gòu)單元的微陣列芯片，以此來研究miRNA序列中嘌呤及嘧啶的相對(duì)比率，并通過最小二乘法分析成功實(shí)現(xiàn)了miRNA捕獲雜交前后拉曼光譜的特征差異探究[13]。無標(biāo)記SERS核酸檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于步驟簡(jiǎn)單，無需對(duì)樣本進(jìn)行特殊處理，但總體而言，該方法尚未能滿足臨床實(shí)際檢測(cè)對(duì)靈敏度及特異性的要求。

表1 SERS無標(biāo)記檢測(cè)及標(biāo)記型檢測(cè)方法分析Table 1 Analysis of the label-free SERS approach and SERS tags-based nucleic acid assays

3.2 標(biāo)記型檢測(cè)

標(biāo)記型檢測(cè)方法通常依賴?yán)鼒?bào)告分子修飾的金屬納米顆粒，通過檢測(cè)拉曼報(bào)告分子強(qiáng)烈而獨(dú)特的拉曼信號(hào)達(dá)到檢測(cè)目的[14-15]。當(dāng)前，基于SERS標(biāo)記型檢測(cè)技術(shù)的核酸檢測(cè)方法，主要包括： “夾心法”、“信號(hào)開關(guān)法”及鏈?zhǔn)诫s交反應(yīng)(hybridization chain reaction,HCR)引起的信號(hào)放大。其中，“夾心法”檢測(cè)策略靈敏度高，具有良好的定量檢測(cè)能力，可應(yīng)用于多元檢測(cè)，是開展SERS標(biāo)記型檢測(cè)DNA/RNA最常用的方法。

3.2.1 “夾心法”檢測(cè)

“夾心法”SERS探針檢測(cè)結(jié)構(gòu)一般由納米金屬核、拉曼活性分子、DNA探針鏈及封閉液構(gòu)成(如圖3所示)。其中，金屬核在SERS探針中用作增強(qiáng)基底，是保證SERS探針實(shí)現(xiàn)高性能檢測(cè)的關(guān)鍵之一。金、銀膠體溶液因制備簡(jiǎn)單、易于保存、表面增強(qiáng)效果好等優(yōu)勢(shì)在SERS探針金屬核的應(yīng)用最為廣泛； 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，相同實(shí)驗(yàn)條件下，納米金顆粒的表面增強(qiáng)能力較納米銀弱10～100倍[16]。在金屬核的結(jié)構(gòu)及形貌方面，伴隨著納米材料制備技術(shù)的迅猛發(fā)展，不拘于早期的單一球形金屬納米顆粒，現(xiàn)已成熟應(yīng)用的還有納米棒、多面體形、星形、樹枝形和花形等； 此外，新型的合金或核殼雙金屬?gòu)?fù)合納米粒子也越來越多地應(yīng)用于SERS探針金屬核，如金核銀殼、銀核金殼等。拉曼活性分子可通過綁定在金屬核表面來實(shí)現(xiàn)拉曼信號(hào)的輸出功能； 常用的拉曼活性分子可大致分為三類： 含氮陽離子染料(如結(jié)晶紫、羅丹明6G等)、含硫染料(如孔雀石綠)以及硫代小分子(如4-氨基苯硫酚、4-甲基苯硫酚等)[17]。DNA探針鏈?zhǔn)潜ＷC實(shí)現(xiàn)SERS探針特異性靶向識(shí)別檢測(cè)目標(biāo)序列的關(guān)鍵，將DNA探針鏈在金屬核表面的固定方法主要有兩種： 一是通過巰基形成S-金屬共價(jià)鍵，以及通過氨基和羧基縮合形成酰胺鍵，從而將DNA探針有序組裝到金屬核表面。

此外，為了保證上述SERS探針的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及特異性檢測(cè)，通常需要對(duì)SERS探針結(jié)構(gòu)外表面進(jìn)行封閉，常用的封閉液有BSA和MCH等。Zhou等[19]在構(gòu)建“夾心”SERS標(biāo)簽的基礎(chǔ)上，研制了一種以細(xì)菌為模板的Ag微球作為信號(hào)放大基底，如圖4所示，該方法設(shè)計(jì)了3種分別結(jié)合了不同拉曼信號(hào)分子(44DP，4-ATP，DTNB)的“夾心”SERS標(biāo)簽，通過捕獲探針將SERS標(biāo)簽結(jié)合在Ag微球表面，通過對(duì)SERS標(biāo)簽的檢測(cè)可達(dá)到同時(shí)檢測(cè)3種肝癌腫瘤標(biāo)志物miRNA-21，miRNA-122，miRNA-223的目的。從SERS光譜檢測(cè)結(jié)果圖中顯示： 該方法在具有較高靈敏度與特異性的同時(shí)，成功實(shí)現(xiàn)了多個(gè)腫瘤標(biāo)志物的高通量檢測(cè)。

圖3 “夾心法”SERS核酸檢測(cè)結(jié)構(gòu)示意圖[18]Fig.3 Scheme of SERS-based nucleic acid detectionbased on sandwich structure[18]

Li等[20]以銀納米粒為核標(biāo)記探針拉曼分子并包裹二氧化硅殼(Ag nanorice @ MGITC @ SiO2)作為SERS 探針，利用光刻技術(shù)在硅圓片上形成三角狀金納米膜作為SERS活性檢測(cè)基底，實(shí)現(xiàn)了乙型肝炎病毒DNA的檢測(cè)，檢測(cè)限達(dá)到50 amol·L-1。Kang等[21]在直徑約為150 nm的金納米棒上構(gòu)建檢測(cè)基底，與球形金納米顆粒探針一起實(shí)現(xiàn)了對(duì)復(fù)合病原體DNA的檢測(cè)，檢測(cè)限達(dá)到10 pmol·L-1。Liu等[22]通過合成寡核苷酸修飾的Ag納米結(jié)構(gòu)為增強(qiáng)基底，并采用DTNB、4-MBA標(biāo)記、并用寡核苷酸修飾的Au納米粒子作為SERS標(biāo)簽，直接在水溶液中進(jìn)行DNA檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示目標(biāo)DNA濃度在10-11～10-8mol·L-1范圍時(shí)，目標(biāo)DNA的濃度對(duì)數(shù)與SERS信號(hào)強(qiáng)度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，此實(shí)驗(yàn)方法可與固相檢測(cè)方法的靈敏度相媲美。

3.2.2 信號(hào)開關(guān)法

“信號(hào)開關(guān)法”一般是通過分子探針與目標(biāo)序列的結(jié)合實(shí)現(xiàn)。如圖5所示，根據(jù)目標(biāo)DNA/RNA序列針對(duì)性地設(shè)計(jì)與目標(biāo)序列結(jié)合過程中可發(fā)生可逆性解離、聚合的發(fā)夾型DNA探針鏈，在探針鏈的兩端分別標(biāo)記上固定基團(tuán)(如巰基)和拉曼活性分子，探針鏈通過固定基團(tuán)組裝到SERS活性基底表面，從而成功構(gòu)建發(fā)夾型SERS檢測(cè)探針。該發(fā)夾型探針要求探針鏈含有與目標(biāo)DNA/RNA序列完全互補(bǔ)的環(huán)狀序列，通過與目標(biāo)DNA/RNA序列的結(jié)合實(shí)現(xiàn)環(huán)鏈的打開，拉曼活性分子遠(yuǎn)離基底表面，從而使SERS信號(hào)強(qiáng)度發(fā)生變化[23]。

Song等[24]采用發(fā)夾型SERS檢測(cè)探針同時(shí)檢測(cè)3種肺癌miRNA標(biāo)志物(miRNA 21，miRNA 486，miRNA 375)，如圖6(a)，通過設(shè)計(jì)與目標(biāo)miRNA完全互補(bǔ)的3種發(fā)夾型SERS檢測(cè)探針，并將探針吸附結(jié)合于銀納米棒微陣列基板上。當(dāng)目標(biāo)miRNAs存在時(shí)，發(fā)夾探針環(huán)序列打開，拉曼活性分子遠(yuǎn)離銀基底表面，SERS信號(hào)由“ON”到“OFF”，信號(hào)強(qiáng)度顯著降低。通過監(jiān)測(cè)SERS信號(hào)值的變化達(dá)到定量檢測(cè)血清中目標(biāo)miRNAs的目的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示： 利用該方法檢測(cè)人血清中miRNAs的LOD值為： miRNA 21/393 amol·L-1，miRNA 486/176amol·L-1，miRNA 375/144 amol·L-1。

在另一項(xiàng)分析中，Wang等[25]開發(fā)了一個(gè)SERS信號(hào)由“OFF”到“ON”的信號(hào)開關(guān)，他們稱之為“反向分子哨兵(inverse molecular sentinel,iMS)”納米探針，以區(qū)別于之前的“ON”到“OFF”開關(guān)。如圖6(b)，在此項(xiàng)研究中，以一條單鏈DNA作為“占位”鏈與納米探針的莖環(huán)序列雜交，發(fā)夾探針的環(huán)序列打開，從而使拉曼報(bào)告分子遠(yuǎn)離金屬納米顆粒表面； 當(dāng)目標(biāo)序列出現(xiàn)時(shí)，占位DNA鏈與納米探針序列解離，探針序列重新形成發(fā)夾型結(jié)構(gòu)，拉曼報(bào)告分子移動(dòng)到金屬納米顆粒表面，從而產(chǎn)生強(qiáng)烈的SERS信號(hào)，從圖6(b)中的SERS光譜圖可以看出，譜線b(樣本組)呈現(xiàn)出的SERS信號(hào)遠(yuǎn)高于譜線a(空白對(duì)照組)，從而佐證了該方法的可行性。

3.2.3 HCR信號(hào)放大法

鏈?zhǔn)诫s交反應(yīng)(hybridization chain reaction,HCR)是一種在室溫條件下進(jìn)行的無酶、線性擴(kuò)增方法。在HCR反應(yīng)的溶液中存在著穩(wěn)定的DNA發(fā)夾探針，觸發(fā)鏈的進(jìn)入可引發(fā)一系列的雜交反應(yīng)，最終形成雙螺旋DNA聚合物。HCR信號(hào)放大聯(lián)合SERS檢測(cè)的方法是在DNA聚合物上連接由拉曼活性分子包被的金屬納米顆粒，由金屬納米顆粒形成的“熱點(diǎn)”效應(yīng)可顯著實(shí)現(xiàn)拉曼信號(hào)放大并最終達(dá)到定量檢測(cè)靶序列的目的。

與酶促擴(kuò)增檢測(cè)法相比，HCR反應(yīng)操作簡(jiǎn)單且成本更低，僅靠單鏈DNA即可實(shí)現(xiàn)雙鏈DNA聚合物大小的原位調(diào)節(jié)。Li等[26]設(shè)計(jì)了一種以靶序列為觸發(fā)鏈的HCR信號(hào)放大聯(lián)合SERS檢測(cè)miRNA-141的方法，如圖7(a)所示，該方案中的捕獲探針由捕獲鏈、Au納米顆粒及拉曼信號(hào)分子構(gòu)成，由靶序列miRNA-141觸發(fā)形成的雙鏈DNA聚合物通過納米磁珠產(chǎn)生聚集后，捕獲探針通過捕獲鏈特異性結(jié)合DNA聚合物上的粘性末端，使得Au納米顆粒在聚合物上形成“熱點(diǎn)” 效應(yīng)，通過檢測(cè)放大后的拉曼信號(hào)達(dá)到定量檢測(cè)復(fù)雜生物樣本中miRNA-141的目的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利用該方法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中miRNA-141，其線性有效檢測(cè)范圍為10-15～10-7mol，LOD值可達(dá)0.17 fmol·L-1。

圖6 (a)一種用于高通量檢測(cè)miRNAs的功能化發(fā)夾探針SERS傳感器原理圖[24]； (b)SERS“反向分子哨兵(IMS)”納米探針檢測(cè)原理圖[25]Fig.6 (a) Schematic illustration of the molecular beacons functionalized-SERS sensor for simultaneously measuringmultiple miRNAs[24]; (b) Detection scheme of the SERS “inverse Molecular Sentinel” nanoprobes[25]

圖7 HCR信號(hào)放大SERS核酸檢測(cè)示例圖[26-27]Fig.7 Scheme of SERS-based nucleic acid detection based on the signal amplification of hybridization chain reaction[26-27]

在后續(xù)的研究中，Liu等[27]采用HCR聯(lián)合銀納米顆粒形成的“熱點(diǎn)”效應(yīng)，如圖7(b)，在微陣列硅基片上成功實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞的miRNA-21檢測(cè)，如圖7所示，該方案采用DBDT(4,4’-biphenyldithiol)作為拉曼信號(hào)分子并連接形成間隔距離為1 nm的AgNP二聚體，從而產(chǎn)生典型的SERS “熱點(diǎn)”； 當(dāng)修飾有捕獲鏈的硅基片上引入靶序列miRNA-21后，發(fā)生的一系列HCR反應(yīng)將大量AgNP富集，從而產(chǎn)生超強(qiáng)拉曼信號(hào)； 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法特異性好，對(duì)單堿基突變及雙堿基突變序列的檢測(cè)信號(hào)點(diǎn)分別僅為12.4%和4.6%(定義對(duì)靶序列miRNA-21的檢測(cè)信號(hào)點(diǎn)100%)。

4 與SERS技術(shù)聯(lián)用的核酸檢測(cè)方法

4.1 SERS聯(lián)合PCR核酸檢測(cè)方法

基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的SERS技術(shù)主要是目標(biāo)DNA片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與SERS探針結(jié)合，在激光照射下產(chǎn)生SERS信號(hào)，根據(jù)SERS光譜實(shí)現(xiàn)DNA檢測(cè)。He等[28]利用RCA擴(kuò)增技術(shù)及SERS信號(hào)開關(guān)技術(shù)建立了一種miRNA超靈敏檢測(cè)方法，在磁性納米顆粒上連接功能性發(fā)夾探針，發(fā)夾探針一端連接納米金顆粒； 原始狀態(tài)下，磁性納米顆粒上的發(fā)夾探針通過與占位DNA鏈的結(jié)合-環(huán)鏈打開，Cy5遠(yuǎn)離磁性納米顆粒，拉曼信號(hào)弱，信號(hào)開關(guān)處于閉合狀態(tài)； 通過引入RCA擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA觸發(fā)鏈后，該觸發(fā)鏈競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合占位DNA鏈，發(fā)夾探針的形成環(huán)序列，拉曼活性分子靠近磁性納米顆粒并在SERS效應(yīng)的影響下產(chǎn)生強(qiáng)烈的拉曼信號(hào)，從而達(dá)到超靈敏檢測(cè)miRNA-150的目的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示： 此檢測(cè)方法的LOD值為70.2 amol·L-1,有效線性檢測(cè)范圍為100 amol·L-1～100 pmol·L-1。SERS聯(lián)合PCR核酸檢測(cè)方法在微量檢測(cè)及樣本處理方面具有諸多優(yōu)勢(shì)，通過PCR技術(shù)可以成功實(shí)現(xiàn)對(duì)靶序列的重組及濃度放大，從而達(dá)到超靈敏檢測(cè)的目的。

4.2 SERS聯(lián)合酶切技術(shù)的核酸檢測(cè)方法

基于酶切技術(shù)的核酸SERS檢測(cè)主要是借助金屬納米顆粒之間“熱點(diǎn)”的優(yōu)異SERS增強(qiáng)性能，利用ss-DNA的自組裝增加熱點(diǎn)形成的概率，利用酶切反應(yīng)進(jìn)行熱點(diǎn)消除，來實(shí)現(xiàn)SERS信號(hào)從弱到強(qiáng)再?gòu)膹?qiáng)到弱的變化。Crew等[29]在包被了拉曼活性分子的金納米顆粒之間設(shè)計(jì)并連接了一條30 bp的DNA雙鏈，通過DNA雙鏈連接形成的金納米顆粒多聚體形成了大量SERS“熱點(diǎn)”，可產(chǎn)生較強(qiáng)的SERS信號(hào)； 當(dāng)限制性內(nèi)切酶作用于DNA雙鏈時(shí)，“熱點(diǎn)”消失，SERS信號(hào)顯著減弱，由此根據(jù)SERS信號(hào)的變化可以實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA雜交及限制性酶切過程的檢測(cè)。SERS聯(lián)合酶切技術(shù)的核酸檢測(cè)方法可成功實(shí)現(xiàn)在液相環(huán)境中的DNA組裝及核酸有效檢測(cè)，充分發(fā)揮了金屬納米顆粒之間SERS“熱點(diǎn)”的優(yōu)勢(shì)，達(dá)到高靈敏檢測(cè)的目的。該研究清楚地驗(yàn)證了DNA自組裝及酶切反應(yīng)在SERS“熱點(diǎn)效應(yīng)”形成過程中的能力，這對(duì)于制定新的生物分析策略具有重要意義。

關(guān)于SERS技術(shù)在核酸檢測(cè)中的應(yīng)用研究主要集中在不同SERS增強(qiáng)基底、不同靶標(biāo)捕獲方式、不同信號(hào)放大方式等方面，基底功能化、多種拉曼報(bào)告分子形成多元檢測(cè)、“熱點(diǎn)效應(yīng)”的產(chǎn)生及減弱已成為SERS核酸檢測(cè)的主要趨勢(shì)，表2為SERS技術(shù)在核酸檢測(cè)中的應(yīng)用。

表2 SERS在核酸檢測(cè)中的應(yīng)用Table 2 Typical research about SERS used for detection on nucleic acids

5 SERS技術(shù)走向臨床應(yīng)用的技術(shù)發(fā)展方向

SERS技術(shù)作為一種新興的快速檢測(cè)方法，因其特有的指紋圖譜、無損性、高靈敏度、操作簡(jiǎn)單且不受水干擾等技術(shù)優(yōu)勢(shì)，已成為核酸檢測(cè)領(lǐng)域近年來的研究熱點(diǎn)。然而，SERS技術(shù)在臨床應(yīng)用方面仍然存在著諸多挑戰(zhàn)： (1)大規(guī)模生產(chǎn)重現(xiàn)性能好、可長(zhǎng)期穩(wěn)定儲(chǔ)存的高靈敏度SERS探針較難實(shí)現(xiàn)，目前常用的Au和Ag納米顆粒在溶液中極易產(chǎn)生聚集，并且拉曼活性分子與納米顆粒的結(jié)合穩(wěn)定性差，因此，對(duì)SERS探針表面結(jié)構(gòu)的涂層保護(hù)非常重要； (2)為了準(zhǔn)確實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣本中各種循環(huán)標(biāo)志物濃度檢測(cè)，必須首先獲得可信的定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，但由于生物樣本自身的成分復(fù)雜，對(duì)SERS檢測(cè)信號(hào)的干擾因素較多，使得對(duì)臨床樣本的準(zhǔn)確定量檢測(cè)較難成功實(shí)現(xiàn)； (3)研制高靈敏度、易操作、低成本的拉曼光譜儀是將SERS技術(shù)轉(zhuǎn)化為實(shí)際應(yīng)用的關(guān)鍵。我們相信，在多學(xué)科研究人員和臨床工作者的不斷共同努力下，基于SERS的生物樣本檢測(cè)技術(shù)將得到進(jìn)一步改進(jìn)，并將穩(wěn)步向臨床應(yīng)用方向發(fā)展。

6 展 望

拉曼光譜作為一種無損、非接觸式且可重復(fù)的快速檢測(cè)技術(shù)，能夠提供分子結(jié)構(gòu)振動(dòng)的指紋圖譜信息且譜峰窄不易發(fā)生重疊，在生化物質(zhì)檢測(cè)中具有顯著優(yōu)勢(shì)。SERS有望實(shí)現(xiàn)高靈敏分析檢測(cè)核酸的技術(shù)，在臨床分子診斷、食品安全、病原微生物檢測(cè)領(lǐng)域展現(xiàn)了潛在的應(yīng)用價(jià)值。相信隨著納米技術(shù)、生物芯片、微流體技術(shù)的進(jìn)步以及便攜式拉曼光譜儀、生物樣本拉曼光譜數(shù)據(jù)庫(kù)的完善，SERS技術(shù)會(huì)在不久的將來廣泛應(yīng)用于生物樣本檢測(cè)，尤其是核酸分子診斷領(lǐng)域，為臨床實(shí)驗(yàn)室診斷提供一種強(qiáng)大的分析技術(shù)。