高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定食用菌中無(wú)機(jī)汞和甲基汞

陳紹占,劉麗萍,3?,張妮娜,周天慧

(1.北京市疾病預(yù)防控制中心食物中毒診斷溯源技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100013;2.北京市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心,北京 100013; 3.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,北京100069)

汞在自然界中分布很廣,汞是對(duì)人類和環(huán)境最具危害性的元素之一。食品中的汞污染由來(lái)已久,汞的測(cè)定一直是食品安全關(guān)注的問(wèn)題。汞及其化合物具有很強(qiáng)的毒性,汞對(duì)生物的毒性不僅取決于其含量,更與其存在的化學(xué)形態(tài)及生物本身密切相關(guān),一般來(lái)說(shuō),烷基汞的毒性比芳基汞和無(wú)機(jī)汞的毒性大[1]。無(wú)機(jī)汞易通過(guò)生物甲基化作用生成毒性更強(qiáng)的烷基汞,并通過(guò)食物鏈的富集作用進(jìn)入人體,對(duì)環(huán)境和人類健康構(gòu)成極大的安全隱患[2]。相比于綠色植物,蘑菇更易富集高含量的鉛、砷、鎘和汞等重金屬元素,這會(huì)給消費(fèi)者帶來(lái)嚴(yán)重危害[3-5]。雖然GB/T 2762－2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》規(guī)定了食用菌及其制品中總汞限量為0.1 mg·kg－1,但僅對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物及其制品、肉食性魚類及其制品中甲基汞的含量進(jìn)行了規(guī)定。我國(guó)是食用菌消費(fèi)大國(guó),也是食用菌出口大國(guó),因此準(zhǔn)確測(cè)定食用菌中甲基汞的含量對(duì)食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有重要意義。目前關(guān)于食用菌中甲基汞測(cè)定的報(bào)道較少,急需建立相應(yīng)的測(cè)定方法以保障食品安全。

目前,常見的測(cè)定汞形態(tài)的方法主要有液相色譜-原子熒光光譜法(LC-AFS)[6-8]、液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(LC-ICP-MS)[9-11]和氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[12-14]。其中LC-ICP-MS 具有連接簡(jiǎn)單、靈敏度高、線性范圍寬、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),已成為測(cè)定汞形態(tài)的主流方法之一。因此,本工作采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(HPLC-ICP-MS)對(duì)食用菌中的無(wú)機(jī)汞及甲基汞進(jìn)行測(cè)定。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1260型高效液相色譜儀;7700x型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀;Milliplus 2150型超純水處理系統(tǒng);KQ-500DV 型數(shù)控超聲清洗器(可控溫20～80 ℃);Universal 32 型高速離心機(jī);8010s 型粉碎機(jī)。

無(wú)機(jī)汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:100μg·g－1。

甲基汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:(65.2±2.5)μg·g－1,以甲醇為溶劑。

調(diào)諧液:含1μg·L－1的鋰、鎂、釔、鈰、鉈、鈷。

鹽酸、氨水均為優(yōu)級(jí)純;乙酸銨為分析純;L-半胱氨酸為生化試劑;甲醇為色譜純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1)HPLC 條件 Agela Technologies Venusil MP C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5μm);流動(dòng)相為3%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇-40 mmol·L－1乙酸銨-1 g·L－1L-半胱氨酸混合液;流量1.0 mL·min－1;進(jìn)樣體積50μL。

2)ICP-MS條件 射頻功率1 550 W;采樣深度8 mm;霧化室溫度2 ℃;載氣流量0.85 L·min－1,補(bǔ)償氣流量0.15 L·min－1;監(jiān)測(cè)質(zhì)量數(shù)為202;積分時(shí)間為0.5 s;蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速為0.3 r·s－1。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取干食用菌樣品0.200～1.000 g置于15 mL塑料離心管中,加入5 mol·L－1鹽酸溶液10 mL,在冰水浴中超聲提取60 min,期間振搖數(shù)次,然后在4℃下以8 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心15 min。移取2 mL上清液至5 mL容量瓶或刻度試管中,在冰水浴中逐滴加入50%(體積分?jǐn)?shù),下同)氨水,調(diào)節(jié)樣品溶液pH 至3～7,再加入10 g·L－1L-半胱氨酸溶液0.1 mL,最后用水稀釋至刻度,經(jīng)0.45μm 有機(jī)系濾膜過(guò)濾,在儀器工作條件下進(jìn)行測(cè)定。同時(shí)做空白試驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)初期以甲醇-60 mmol·L－1乙酸銨-1 g·L－1L-半胱氨酸混合液作為流動(dòng)相,考察了流動(dòng)相中甲醇的體積分?jǐn)?shù)依次為1%,2%,3%,4%,5%時(shí)對(duì)無(wú)機(jī)汞和甲基汞的峰面積和保留時(shí)間的影響,結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 甲醇的體積分?jǐn)?shù)對(duì)無(wú)機(jī)汞和甲基汞峰面積的影響Fig.1 Effect of volume fraction of methanol on peak area of inorganic mercury and methylmercury

圖2 甲醇的體積分?jǐn)?shù)對(duì)無(wú)機(jī)汞和甲基汞保留時(shí)間的影響Fig.2 Effect of volume fraction of methanol on retention time of inorganic mercury and methylmercury

由圖1可知:流動(dòng)相中加入甲醇對(duì)無(wú)機(jī)汞、甲基汞的測(cè)定具有增敏作用;當(dāng)甲醇的體積分?jǐn)?shù)超過(guò)3%時(shí),增敏作用不再明顯增強(qiáng);甲醇體積分?jǐn)?shù)為2%時(shí),無(wú)機(jī)汞的信號(hào)最佳;隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加,甲基汞的峰面積逐漸增加。

由圖2可知:隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加,無(wú)機(jī)汞的保留時(shí)間基本不發(fā)生變化,甲基汞的保留時(shí)間逐漸減小。故甲醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)大,會(huì)導(dǎo)致無(wú)機(jī)汞和甲基汞分離度變差。

綜上所述,同時(shí)考慮到長(zhǎng)時(shí)間將高含量的有機(jī)相進(jìn)入儀器,會(huì)在電感耦合等離子體質(zhì)譜儀的采樣錐和截取錐上產(chǎn)生碳富集,進(jìn)而影響靈敏度,對(duì)采樣錐和截取錐損耗也較大。試驗(yàn)選擇流動(dòng)相中甲醇的體積分?jǐn)?shù)3%。

在實(shí)際樣品分析過(guò)程中發(fā)現(xiàn):食用菌樣品中無(wú)機(jī)汞含量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致峰拖尾,從而影響甲基汞的測(cè)定。為了保證無(wú)機(jī)汞和甲基汞具有較好的分離度,試驗(yàn)中適當(dāng)降低流動(dòng)相中乙酸銨的濃度,同時(shí)該操作還可以有效延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命。綜合考慮,試驗(yàn)選擇流動(dòng)相為3%甲醇-40 mmol·L－1乙酸銨-1 g·L－1L-半胱氨酸混合液。

2.2 ICP-MS條件的選擇

開機(jī)預(yù)熱后,使用調(diào)諧液對(duì)儀器各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行調(diào)諧,使靈敏度、氧化物、雙電荷及背景噪聲達(dá)到要求,將優(yōu)化的各項(xiàng)參數(shù)保存到分析方法中。

汞在自然界中共有6個(gè)同位素,其中豐度比較高的同位素有199Hg、200Hg、201Hg、202Hg,豐度分別為16.87%,23.10%,13.18%,29.86%。上述同位素分別容易受到183W16O、184W16O、185Re16O、186W16O等多原子離子的干擾,然而可能存在干擾的物質(zhì)幾乎不存在于食品基體中。試驗(yàn)選擇了豐度最高的202Hg的質(zhì)量數(shù)202 作為監(jiān)測(cè)的質(zhì)量數(shù),樣品基質(zhì)中無(wú)質(zhì)譜干擾。

試驗(yàn)選擇的ICP-MS條件見1.2節(jié)。

2.3 前處理?xiàng)l件的選擇

目前食品樣品的提取多采用5 mol·L－1鹽酸溶液作為提取劑。高效液相色譜-原子熒光光譜法測(cè)定汞形態(tài)可采用氫氧化鈉溶液中和鹽酸溶液調(diào)節(jié)酸度。但采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定時(shí),采用氫氧化鈉溶液中和鹽酸溶液會(huì)引入高含量的鈉鹽,導(dǎo)致等離子體的電離效率及穩(wěn)定性降低,影響數(shù)據(jù)結(jié)果的穩(wěn)定性。試驗(yàn)選用50%氨水調(diào)節(jié)酸度。

樣品溶液酸堿性對(duì)無(wú)機(jī)汞和甲基汞測(cè)定的影響見圖3。

圖3 樣品溶液酸堿性對(duì)無(wú)機(jī)汞和甲基汞測(cè)定的影響Fig.3 Effect of acidity and alkalinity of sample solution on determination of inorganic mercury and methylmercury

由圖3可知:若樣品溶液調(diào)至弱堿性,無(wú)機(jī)汞和甲基汞保留時(shí)間后移,且在無(wú)機(jī)汞原出峰位置有個(gè)明顯的倒峰,影響無(wú)機(jī)汞的測(cè)定,導(dǎo)致無(wú)機(jī)汞測(cè)定結(jié)果偏低。試驗(yàn)選擇樣品溶液為弱酸性。Agela Technologies Venusil MP C18色譜柱屬于中等極性柱,適用pH 范圍較寬(1.5～8.5)。將pH 控制在3～7即可保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性,又可有效保護(hù)色譜柱。

超聲提取時(shí),為避免水分子振蕩摩擦使水溫升高,可通過(guò)加注冰水降溫使水溫控制在50 ℃以下。

中和反應(yīng)滴加50%氨水速率不宜太快,避免酸堿中和放熱劇烈導(dǎo)致無(wú)機(jī)汞揮發(fā)或甲基汞形態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)化,影響測(cè)定結(jié)果。滴加50%氨水時(shí)應(yīng)在冰水浴下逐滴緩慢加入。

2.4 甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性

甲基汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的溶劑為甲醇,其在冰箱冷凍室(－20 ℃)可保存兩年。試驗(yàn)中首先用50%甲醇溶液將甲基汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液稀釋成10.00 mg·L－1甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液,再用流動(dòng)相將10.00 mg·L－1甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋至50.00μg·L－1,按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定,監(jiān)測(cè)24 h 內(nèi)的變化。結(jié)果顯示:24h 內(nèi)有0.11%的甲基汞轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)汞,為保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性,甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液需現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

移取適量的無(wú)機(jī)汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和甲基汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液用流動(dòng)相稀釋混合配制成0,0.10,0.50,1.00,5.00,10.00,30.00,50.00μg·L－1的無(wú)機(jī)汞和甲基汞混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列(現(xiàn)用現(xiàn)配)。按儀器工作條件對(duì)無(wú)機(jī)汞和甲基汞的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定,以無(wú)機(jī)汞和甲基汞的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:無(wú)機(jī)汞和甲基汞的線性范圍均為0.10～50.00μg·L－1,線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表1。

以3倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為方法的檢出限(3S/N),無(wú)機(jī)汞和甲基汞的檢出限見表1。

表1 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Tab.1 Linear regression equations,correlation coefficients and detection limits

2.6 精密度和回收試驗(yàn)

按試驗(yàn)方法對(duì)食用菌樣品進(jìn)行分析,并進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),平行測(cè)定6次,計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表2。

表2 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表2 可知:無(wú)機(jī)汞的回收率為99.4%～103%,RSD 為1.6%～3.0%;甲基汞的回收率為94.6%～96.6%,RSD 為1.7%～4.7%。

2.7 樣品溶液的穩(wěn)定性

向真姬菇樣品中加入適量的無(wú)機(jī)汞和甲基汞混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按試驗(yàn)方法進(jìn)行分析,監(jiān)測(cè)24 h內(nèi)測(cè)定結(jié)果的變化情況,結(jié)果見表3。

由表3可知:在監(jiān)測(cè)時(shí)間內(nèi)無(wú)機(jī)汞的平均回收率為106%,甲基汞的平均回收率為95.5%,說(shuō)明本方法的穩(wěn)定性良好。隨著監(jiān)測(cè)時(shí)間的延長(zhǎng),無(wú)機(jī)汞的測(cè)定值有逐漸增大的趨勢(shì),甲基汞的測(cè)定值有逐漸降低的趨勢(shì),說(shuō)明甲基汞在樣品溶液中存在微量轉(zhuǎn)化的情況。因此,樣品提取完成后應(yīng)在12 h(甲基汞回收率為95.0%)內(nèi)完成測(cè)定,避免長(zhǎng)時(shí)間放置導(dǎo)致甲基汞向無(wú)機(jī)汞的轉(zhuǎn)化。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of test for stability

2.8 方法對(duì)比試驗(yàn)

分別按試驗(yàn)方法和GB/T 5009.17－2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中總汞及有機(jī)汞的測(cè)定》中的LC-AFS測(cè)定3種食用菌樣品中無(wú)機(jī)汞和甲基汞的含量,結(jié)果見表4。

表4 方法對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of test for method comparison μg·kg－1

經(jīng)配對(duì)T檢驗(yàn),3種食用菌樣品的P值均大于0.05,說(shuō)明兩種方法的測(cè)定結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,兩種方法測(cè)定無(wú)機(jī)汞和甲基汞的結(jié)果一致。

2.9 樣品分析

按試驗(yàn)方法對(duì)7種食用菌樣品中的汞形態(tài)進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見表5,其中,無(wú)機(jī)汞、甲基汞總量為無(wú)機(jī)汞、甲基汞含量的總和,總汞為電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定結(jié)果。

由表5可知:樣品中無(wú)機(jī)汞的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為457～1 526 μg·kg－1,甲基汞的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.6～134μg·kg－1;無(wú)機(jī)汞與總汞比值為73.0%～94.4%,甲基汞與總汞比值為1.2%～7.6%;提取效率為80.6%～96.2%。食用菌中汞的形態(tài)主要為無(wú)機(jī)汞,甲基汞的占比較小。

表5 樣品分析結(jié)果Tab.5 Analytical results of samples

本工作采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定食用菌中無(wú)機(jī)汞和甲基汞的含量。方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、精密度高、準(zhǔn)確度好,與液相色譜-原子熒光光譜法進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果一致,本方法適用于食用菌中無(wú)機(jī)汞和甲基汞的測(cè)定。