靶向p53-MDM2通路的相關(guān)抑制劑研究進(jìn)展

劉佳敏，付毅紅，樊思莉，粱俸銘，謝德文，王貞超,2,3*，歐陽(yáng)貴平,2,3*

(1. 貴州大學(xué) 藥學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025; 2. 貴州醫(yī)科大學(xué) 藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng) 550014; 3. 貴州省合成藥物工程實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng) 550025)

p53基因是研究最廣泛的抑癌基因之一，野生型的p53基因具有廣譜的腫瘤抑制作用，與細(xì)胞周期、分化、DNA修復(fù)、凋亡都有密切聯(lián)系.在外界因素的影響下,p53基因容易發(fā)生錯(cuò)義突變，突變型p53基因具有誘發(fā)腫瘤的可能性.研究表明，在所有惡性腫瘤中，50%以上都出現(xiàn)了該基因的突變[1].MDM2是p53主要的負(fù)調(diào)控因子，其編碼的蛋白能與p53蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，從而使p53基因失活無(wú)法發(fā)揮正常的腫瘤抑制功能[2].近年來(lái)，設(shè)計(jì)能夠靶向野生型p53與MDM2相互作用的化合物，激活野生型p53的腫瘤抑制功能是腫瘤治療的新策略之一.本文對(duì)靶向p53-MDM2通路的相關(guān)抑制劑進(jìn)行綜述，以期為研究以蛋白-蛋白相互作用為靶點(diǎn)的抗腫瘤新藥物研發(fā)提供有價(jià)值的參考.

1 p53與MDM2的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

p53基因定位于人類(lèi)染色體上的17p13.1，共編碼393個(gè)氨基酸，形成一種內(nèi)源性磷酸化蛋白p53蛋白.p53基因可分為5個(gè)功能區(qū)域[3]，依次分為N端反式激活域(殘基1-62)，該結(jié)構(gòu)域存在三個(gè)關(guān)鍵的氨基酸殘基Phe19、Trp23和Leu26，可與基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)蛋白相互作用；同樣在N端的富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域(殘基63-94)；核心DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(殘基94-292)，該區(qū)域可與特異性雙鏈DNA序列結(jié)合，維持p53蛋白的穩(wěn)定性；寡聚結(jié)構(gòu)域位于C端區(qū)域(殘基325-356)；而C末端是基本調(diào)控區(qū)(殘基357-393)，也被認(rèn)為是調(diào)控p53序列特異性結(jié)合的區(qū)域，對(duì)于蛋白酶體也較為敏感[4-6].MDM2(Murine Double Minute 2)，也被稱(chēng)作HDM2.該基因位于人類(lèi)染色體12q14.3～q15，全長(zhǎng)491個(gè)氨基酸，依次分為p53結(jié)合區(qū)(18-101)、酸性區(qū)(237-288)、鋅指區(qū)(289-331)和環(huán)區(qū)(436-482)，還包括兩個(gè)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子序列P1和P2，并以p53依賴(lài)性方式響應(yīng)細(xì)胞應(yīng)激刺激[7].MDM2作為p53下游基因的調(diào)節(jié)因子，能夠參與調(diào)控p53蛋白穩(wěn)定性及其活性，并與p53轉(zhuǎn)錄激活域的N末端結(jié)合，從而參與細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、凋亡誘導(dǎo)和細(xì)胞周期的調(diào)控[8].

在正常的細(xì)胞中，MDM2與野生型p53有著精細(xì)的平衡，其相互調(diào)節(jié)形成負(fù)反饋回路.p53蛋白能與MDM2上的P2啟動(dòng)子結(jié)合，并在轉(zhuǎn)錄水平上激活MDM2表達(dá)；MDM2蛋白與p53的N端反式激活結(jié)構(gòu)域特別是Phe19、Trp23和Leu26等關(guān)鍵氨基酸殘基結(jié)合，形成p53-MDM2復(fù)合物抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性[9].其次，MDM2蛋白酶體本身可以作為E3泛素連接酶，可介導(dǎo)p53泛素化和降解，使得p53維持在正常生理低水平[10].目前，與p53-MDM2有關(guān)的腫瘤抑制途徑中，研究最廣泛的方法是應(yīng)用具有特異性MDM2蛋白結(jié)合能力的化學(xué)分子，占據(jù)MDM2蛋白上的p53結(jié)合口袋，干擾p53-MDM2復(fù)合物的形成，釋放p53蛋白，發(fā)揮腫瘤抑制功能.下面根據(jù)化合物的來(lái)源及結(jié)構(gòu)類(lèi)型對(duì)靶向p53-MDM2通路的相關(guān)抑制劑進(jìn)行歸納和總結(jié).

2 天然產(chǎn)物類(lèi)p53-MDM2抑制劑

天然產(chǎn)物是開(kāi)發(fā)新型治療和預(yù)防人類(lèi)癌癥藥物的豐富來(lái)源，許多天然產(chǎn)物通過(guò)靶向癌基因或抑癌基因來(lái)介導(dǎo)其抗癌活性，與靶向單個(gè)分子靶點(diǎn)而設(shè)計(jì)合成的抗癌化合物相比，大多數(shù)抗癌天然產(chǎn)物具有更廣泛的靶點(diǎn)，包括MDM2癌基因和p53抑癌基因[11].近年來(lái)作用于p53-MDM2通路的天然產(chǎn)物也被相繼報(bào)道(圖1).

Chlorofusin是由鐮刀菌屬(Fusariumsp.)微真菌發(fā)酵得到的代謝產(chǎn)物，也是第一種從自然資源中分離得來(lái)的天然肽類(lèi)p53-MDM2相互作用抑制劑.體外活性測(cè)試表明，Chlorofusin對(duì)HepG2的細(xì)胞毒性較低，能夠有效抑制p53與MDM2蛋白之間的相互作用(IC50= 4.6 μmol/L,KD= 4.7 μmol/L)[12].Chlorofusin作為首個(gè)天然產(chǎn)物類(lèi)p53-MDM2抑制劑，其良好的生物學(xué)活性及其新穎的結(jié)構(gòu)為后續(xù)發(fā)現(xiàn)更多天然產(chǎn)物類(lèi)蛋白-蛋白相互作用抑制劑提供參考.(-)-Hexylitaconicacid是從海洋衍生真菌(Archidiumsp.)的培養(yǎng)液中分離出來(lái)的產(chǎn)物，也是第二個(gè)從天然資源中分離得到的p53-MDM2相互作用抑制劑.采用ELISA法測(cè)得(-)-Hexylitaconicacid以劑量依賴(lài)性方式抑制p53-MDM2結(jié)合，其IC50值為50 mg/L，該化合物能模擬p53反式激活結(jié)構(gòu)域占據(jù)MDM2口袋上的疏水裂縫，抑制兩者相互作用，可作為治療癌癥的先導(dǎo)化合物[13].藍(lán)藻提取物HoiamidLD是第二種來(lái)自天然產(chǎn)物的肽類(lèi)p53-MDM2抑制劑，該化合物是一種聚酮合成酶(PKS)/非核糖體肽合成酶(NRPS)衍生的天然產(chǎn)物，具有兩個(gè)連續(xù)的噻唑啉和噻唑以及修飾的異亮氨酸殘基，抑制p53-MDM2相互作用的EC50為4.5 μmol/L，表現(xiàn)出良好的抑制活性，但具體的作用位點(diǎn)尚不明確，有待進(jìn)一步探討[14].

除了藻類(lèi)及真菌類(lèi)代謝產(chǎn)物分離得到p53-MDM2抑制劑，部分科學(xué)家從天然植物中也發(fā)現(xiàn)了許多潛在的p53-MDM2抑制劑.STOLL等[15]從甘草根中分離出系列查爾酮類(lèi)化合物，研究發(fā)現(xiàn)該類(lèi)化合物能與MDM2上p53結(jié)合裂隙中的色氨酸口袋結(jié)合，抑制p53-MDM2形成復(fù)合物，從而釋放p53蛋白.其中化合物1a、1b、2抑制p53與MDM2相互作用的IC50值分別為206、49、117 μmol/L，能夠有效阻斷兩者形成復(fù)合物，發(fā)揮腫瘤抑制作用.ɑ-Mangostin和Gambogicacid是從藤黃科芒果果實(shí)和藤黃科藤黃樹(shù)脂中獲得的天然蒽酮類(lèi)化合物，對(duì)多種人類(lèi)腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性.此外，研究發(fā)現(xiàn)ɑ-Mangostin能顯著增加細(xì)胞p53的轉(zhuǎn)錄活性，并誘導(dǎo)與Bax蛋白水平升高相關(guān)的凋亡.酵母表型分析顯示，ɑ-Mangostin和Gambogicacid逆轉(zhuǎn)了MDM2對(duì)p53誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和S期細(xì)胞周期阻滯，以及對(duì)p53依賴(lài)的轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用，可作為p53-MDM2相互作用的潛在抑制劑[16].除此之外，植物來(lái)源的多酚化合物Resveratrol(白藜蘆醇)具有一定的抗癌作用，且具有多個(gè)細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo).這些靶標(biāo)影響著細(xì)胞的生長(zhǎng)、炎癥、凋亡、血管生成以及侵襲和轉(zhuǎn)移，其中包括腫瘤抑制因子p53和Rb及細(xì)胞周期蛋白等[17].因此，CLARK等[18]研究了白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞增殖、成球能力和侵襲的影響，并分析AKT和p53的變化，結(jié)果表明，白藜蘆醇能顯著減少AKT磷酸化并誘導(dǎo)p53表達(dá)和激活，從而導(dǎo)致下游p53靶基因的轉(zhuǎn)錄，有望成為新型p53-MDM2抑制劑，發(fā)揮腫瘤抑制作用.Tricetin(曲霉菌素)是由桃金娘科花粉和桉樹(shù)科中分離而來(lái)的類(lèi)黃酮衍生物，也是癌癥治療的理想候選藥物，體外研究表明，該化合物能夠抑制MCF7乳腺癌細(xì)胞(p53野生型)的生長(zhǎng)和集落形成，并誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G2/M期導(dǎo)致細(xì)胞凋亡.研究表明，Tricetin能直接抑制p53-MDM2相互作用并穩(wěn)定p53，并引起p53和磷酸化p53(Ser15)的積聚，具有靶向p53通路發(fā)揮抗癌作用的潛力[19].

圖1 天然產(chǎn)物類(lèi)p53-MDM2抑制劑Fig.1 Natural products as promosing p53-MDM2 inhibitor

近年來(lái)，許多科學(xué)家運(yùn)用現(xiàn)代計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)，針對(duì)p53-MDM2靶點(diǎn)對(duì)天然植物化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行篩選以尋找潛在的候選物.PATIL等[20]通過(guò)虛擬篩選發(fā)現(xiàn)Fluspirilene(氟螺環(huán)烯)具有與天然MDM2晶體配體相似的結(jié)合模式，分子動(dòng)力學(xué)模擬表明，F(xiàn)luspirilene與MDM2上的p53結(jié)合口袋結(jié)合穩(wěn)定，可能導(dǎo)致p53活化.此外，該化合物對(duì)多種類(lèi)型的人類(lèi)腫瘤細(xì)胞株具有廣譜的、p53依賴(lài)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性，可作為潛在的p53-MDM2相互作用的抑制劑.RIAZ等[21]針對(duì)p53-MDM2靶點(diǎn)篩選了2295種植物化學(xué)物質(zhì)的文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)化合物EGCG、AlvaradoinM、及Nordihydroguaiareticacid能占據(jù)MDM2的疏水性裂隙，干擾p53與MDM2結(jié)合.同時(shí)，EGCG能引起細(xì)胞停滯和凋亡，增加p53的表達(dá)，從而治愈與p53-MDM2相關(guān)的惡性腫瘤，可作為先導(dǎo)化合物進(jìn)一步優(yōu)化并分析其抗癌活性.

基于p53-MDM2通路可能是開(kāi)發(fā)治療和預(yù)防癌癥的化合物的一種有效的方法，到目前為止，從天然產(chǎn)物獲得的p53-MDM2抑制劑中，天然肽類(lèi)p53-MDM2抑制劑Chlorofusin及HoiamidLD與傳統(tǒng)抑制劑相比，肽類(lèi)擁有更高的親和力和特異性，使其更加容易結(jié)合并拮抗靶蛋白.其次，由于計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)的興起，尋找更加高效的p53-MDM2先導(dǎo)化合物變得更加方便、快捷.但還未有天然產(chǎn)物類(lèi)MDM2抑制劑進(jìn)入臨床.總體而言，針對(duì)p53-MDM2途徑的天然產(chǎn)物用于癌癥治療和預(yù)防的開(kāi)發(fā)取得了進(jìn)展，但仍有各種問(wèn)題需要解決.特別是，需要對(duì)其體內(nèi)有效性、毒性、生物利用度和作用機(jī)制進(jìn)行更詳細(xì)的研究，以加快開(kāi)發(fā)有效和安全的癌癥預(yù)防和治療藥物用于臨床.

3 小分子類(lèi)p53-MDM2抑制劑

3.1 咪唑啉類(lèi)抑制劑

第一代MDM2小分子抑制劑以1,2,4,5-四取代-4,5-Z-咪唑啉為結(jié)構(gòu)母核，又被稱(chēng)為Nutlin類(lèi)化合物，該類(lèi)化合物通過(guò)占據(jù)MDM2蛋白結(jié)構(gòu)上的p53結(jié)合口袋，誘導(dǎo)p53積聚并恢復(fù)其轉(zhuǎn)錄活性[22].其中先導(dǎo)化合物Nutlin-1、Nutlin-2和Nutlin-3(圖2)的IC50在100～300 nmol/L之間，它們具有足夠的細(xì)胞滲透性，且以劑量依賴(lài)性的方式引起野生型p53的積累，但只有野生型p53細(xì)胞系對(duì)這些化合物敏感[23].通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾得到化合物Nutulin-3a(圖2)，該化合物IC50值達(dá)90 nmol/L，能很好的抑制p53-MDM2蛋白相互作用，并有效地激活癌細(xì)胞中的野生型p53.同時(shí)，Nutlin-3a活性對(duì)映體在較低劑量時(shí)能夠誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，為藥物的研發(fā)提供了參考[24-25].

圖2 咪唑啉類(lèi)抑制劑Fig.2 Nutulins as potent p53-MDM2 inhibitor

研究發(fā)現(xiàn)，許多腫瘤細(xì)胞僅在Nutlin刺激時(shí)誘發(fā)細(xì)胞周期停滯，停藥后又恢復(fù)增殖，不能持續(xù)地消除癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[26].為了克服這些限制，SRIRAMAN等[26]將Nutlin-3a與Wip1抑制劑GSK2830371聯(lián)用治療富含p53的腫瘤細(xì)胞，抑制MDM2的同時(shí)抑制了p53的第二個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)因子磷酸酶Wip1/PPM1D.結(jié)果發(fā)現(xiàn)p53的磷酸化(Ser15)和乙?；?Lys382)增強(qiáng)，p53靶基因產(chǎn)物的表達(dá)增加，與此同時(shí)，兩者還能協(xié)同抑制細(xì)胞增殖.SHUVALOV等[27]發(fā)現(xiàn)Nutlin-3a與干擾素協(xié)同作用可以治療p53缺失的非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞，在蛋白水平上抑制cyclinD 1/CDK 4，從而阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程，為聯(lián)合治療提供了新思路.

RG7112(圖2)是第一個(gè)進(jìn)入臨床的小分子MDM2抑制劑，其KD為11 nmol/L，IC50為18 nmol/L，其活性是Nutulin-3a的4倍.能有效阻斷p53-MDM2的結(jié)合，穩(wěn)定和積聚p53蛋白，激活p53通路.晶體結(jié)構(gòu)表明，其結(jié)構(gòu)中4-氯苯基環(huán)占據(jù)Trp23和Leu26口袋，而乙氧基則突出放入Phe19口袋中(圖3)[25].TOVAR等[28]在MDM2基因擴(kuò)增和蛋白過(guò)表達(dá)的SJSA-1和MHM骨肉瘤細(xì)胞系的人異種移植瘤小鼠模型中，以非毒性濃度通過(guò)口服給藥，發(fā)現(xiàn)RG7112使得小鼠體內(nèi)增殖或凋亡的標(biāo)志物產(chǎn)生劑量依賴(lài)性變化，RG7112單一療法及其聯(lián)合用藥的臨床評(píng)價(jià)正在進(jìn)行中.

圖3 RG7112與MDM2結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)Fig.3 Crystal structure of MDM2 bound to RG7112

Nutlins類(lèi)化合物的由于其較好的生物活性和選擇性激發(fā)了人們對(duì)小分子p53-MDM2抑制劑的廣泛興趣，近年來(lái)，新型咪唑啉類(lèi)MDM2拮抗劑也被相繼報(bào)道.HU等[29]以Nutlins骨架為核心，修飾咪唑啉環(huán)上的2,4,5-三苯基合成了系列的咪唑啉衍生物，它們對(duì)PC3、A549、KB和HCT116腫瘤細(xì)胞株有較好的抑制作用，其中化合物3具有較強(qiáng)的p53-MDM2結(jié)合抑制活性(Ki= 0.6 μmol/L)，且能誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，其作用幾乎是Nultin-1的兩倍，具有一定的研究?jī)r(jià)值.BAZANOV等[30]報(bào)道了系列2,4,5-三(烷氧基芳基)咪唑啉衍生物.生物活性測(cè)試表明，羥基取代化合物對(duì)A549沒(méi)有細(xì)胞毒性，而烷氧基類(lèi)似物4(IC50= 9.32 μmol/L)與鹵素取代化合物5(IC50= 9.05 μmol/L)具有相同或更高的活性.分子對(duì)接顯示，化合物5的順式-甲氧基苯基環(huán)直接插入MDM2結(jié)合位點(diǎn)的兩個(gè)口袋Trp23和Leu26，而第三個(gè)苯基取代基間接到達(dá)第三個(gè)口袋Phe19，結(jié)果與Nutulin-3a相似，可作為先導(dǎo)化合物進(jìn)一步研究.ZHU等[31]報(bào)道了系列雙環(huán)咪唑啉衍生物，其中化合物6對(duì)MDM2抑制作用為0.37 μmol/L.研究表明，化合物6上的甲酯及兩個(gè)苯基通過(guò)氫鍵與His96相互作用，與Lys94通過(guò)靜電相互作用，與MDM2底物口袋中的殘基形成疏水和范德華力相互作用，從而模仿正常p53肽段的Leu26、Phe19和Trp23.該化合物類(lèi)似于RG7112，可誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞中MDM2、p53和p21蛋白的積累并刺激p53的表達(dá)和核定位，最終阻斷MDM2和p53之間的相互作用，具有潛在應(yīng)用價(jià)值.

正常細(xì)胞中，MDM2上的p53結(jié)合口袋有疏水裂縫，p53的反式激活結(jié)構(gòu)域上的關(guān)鍵氨基酸會(huì)與之結(jié)合形成復(fù)合物，阻礙p53發(fā)揮腫瘤抑制功能.科學(xué)家們根據(jù)這一特點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成咪唑啉類(lèi)MDM2拮抗劑，其共同特點(diǎn)是，咪唑啉環(huán)上雙取代苯基模擬關(guān)鍵氨基酸占據(jù)MDM2上的Trp23和Leu26口袋，其余取代基則插入Phe19口袋，從而抑制p53-MDM2作用，發(fā)揮抗腫瘤作用.其相互作用方式也為后續(xù)的p53-MDM2抑制劑提供了重要參考.目前，咪唑啉類(lèi)p53-MDM2抑制劑中，活性最好的化合物RG7112正處于I期臨床研究階段.

3.2 吡咯烷及吡咯酮類(lèi)抑制劑

第二代MDM2抑制劑RG7388是一類(lèi)吡咯烷類(lèi)衍生物，如圖4所示，其先導(dǎo)化合物7的效力比其對(duì)映異構(gòu)體8強(qiáng)50倍，對(duì)野生型p53癌細(xì)胞具有中等效力(IC50= 2.8 μmol/L)，但相對(duì)于p53突變細(xì)胞系只有適度的選擇性(IC50= 22 μmol/L).晶體結(jié)構(gòu)表明，化合物7的4-氯苯基環(huán)嵌入Trp23口袋中、3-氯苯基占據(jù)Leu26口袋、與MDM2上的His96殘基形成π-π堆積相互作用，新戊基與Phe19口袋結(jié)合，吡咯烷Cα羰基與His96的NH(PDB 4JRG)形成氫鍵(圖5)[32].通過(guò)結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到化合物RG7388，研究表明，其與MDM2結(jié)合的Ki值為6 nmol/L，可以有效地激活p53通路，導(dǎo)致野生型p53細(xì)胞系周期阻滯或凋亡，并在裸鼠骨肉瘤異種移植試驗(yàn)中抑制腫瘤的增殖[33].近年來(lái)，ZHUANG等[34]報(bào)道了一類(lèi)新型吡咯烷酮抑制劑，其中化合物9能與MDM2的疏水鍵和氫鍵相互作用且具有良好的p53-MDM2抑制活性(Ki= 780 nmol/L).結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到化合物10，與MDM2結(jié)合的Ki值為260 nmol/L.該化合物對(duì)缺失p53的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出良好的選擇性，在A549異種移植模型中也有效地抑制了腫瘤的生長(zhǎng).此外，化合物10還對(duì)MDMX具有良好的抑制活性(Ki= 2.68 μmol/L)，這表明該化合物可能是p53-MDM2/MDMX相互作用的雙重抑制劑.LI等[35]將芳基部分引入吡咯烷酮支架中，得到了異丙醚-吡咯烷酮和α-苯乙胺-吡咯烷酮衍生物.其中化合物11a和11b顯示出有效的p53-MDM2抑制活性，Ki值均達(dá)90 nmol/L，化合物11a可以有效激活肺癌A549細(xì)胞中的p53蛋白.此外，化合物11b的三個(gè)芳族取代基可以模擬p53的Phe19、Trp23和Leu26殘基，其作用方式與RG7112相似.ZHOU等[36]研究了一系列吡咯并吡唑類(lèi)化合物，發(fā)現(xiàn)化合物12是野生型p53癌細(xì)胞(U2OS)和p53缺失癌細(xì)胞(SAOS-2)具有4倍選擇性的p53-MDM2抑制劑，與MDM2結(jié)合的Ki為0.392 μmol/L，對(duì)野生型U2OS及A549細(xì)胞的體外抑制活性分別為1.2、3.23 μmol/L，具有一定的研究?jī)r(jià)值.

圖4 吡咯烷及吡咯酮類(lèi)p53-MDM2抑制劑Fig.4 Pyrrolidinones and pyrrolidine as p53-MDM2 inhibitors

圖5 先導(dǎo)化合物7與MDM2結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)Fig.5 The crystal structure of lead compound 7 bound to MDM2

目前，吡咯烷類(lèi)p53-MDM2抑制劑進(jìn)展最快的化合物RG7338已經(jīng)進(jìn)入臨床III期研究，成為在臨床試驗(yàn)中進(jìn)展最快小分子p53激活劑，盡管RG7388與Nutlin-3相比，其活性有了很大的改善，但消除p53野生型癌細(xì)胞的能力有限，且可能產(chǎn)生p53突變的耐藥亞群體[37].因此，臨床研究多制定聯(lián)合治療策略.目前，RG7338已作為單一藥物或聯(lián)合阿糖胞苷完成了治療AML的Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)，還可作為單一藥物或聯(lián)合化療手段治療高危野生型p53神經(jīng)母細(xì)胞瘤，提高患者存活率并減少相應(yīng)的毒性[38].其他臨床Ⅰ/Ⅱ期結(jié)果表明RG7338聯(lián)用地塞米松與枸櫞酸依沙唑米可以用來(lái)治療難治性多發(fā)性骨髓瘤[39]，很有可能成為第一個(gè)上市的p53-MDM2抑制劑.

3.3 螺氧吲哚及吲哚類(lèi)抑制劑

DING等[40]在RG7112和RG7388的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了新型螺氧吲哚類(lèi)化合物可作為p53-MDM2抑制劑.其中先導(dǎo)化合物RO8994、RO2468和RO5353(圖6)對(duì)于3株野生型p53細(xì)胞株(SJSA1、RKO、HCT116)有較強(qiáng)的抗增殖活性[41-43].在此基礎(chǔ)上，一系列高效的螺氧吲哚類(lèi)化合物相繼問(wèn)世，其中MI219具有較高的親和力(Ki= 12.3 nmol/L)，以及良好的口服生物利用度和較好的藥代動(dòng)力學(xué)特性[44].ZHAO等[45]通過(guò)優(yōu)化MI-219得到MI888，可以有效地抑制p53-MDM2的相互作用(Ki= 0.44 nmol/L)且具有優(yōu)異的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，能夠在人類(lèi)骨肉瘤和急性淋巴細(xì)胞白血病異種移植模型中實(shí)現(xiàn)快速、完整和持久的腫瘤消退，盡管這些抑制劑的活性較好，但它們的生物利用度、體內(nèi)活性等還需要進(jìn)一步的研究.

圖6 螺環(huán)氧吲哚及吲哚類(lèi)p53-MDM2抑制劑Fig.6 Spirooxindole derivatives as inhibitors for the p53-MDM2

SAR405838(MI-77301)是螺氧化物家族中高度優(yōu)化的化合物，它以高親和力與MDM2結(jié)合(Ki= 0.88 nmol/L)，在SJSA-1骨肉瘤、RS411急性白血病、LNCaP前列腺癌和HCT-116結(jié)腸癌的小鼠異種移植模型中，達(dá)到持久的腫瘤消退或完全腫瘤生長(zhǎng)抑制，引起p53依賴(lài)的細(xì)胞周期阻滯和凋亡[46].晶體研究表明，該化合物除了模仿三個(gè)關(guān)鍵氨基酸外，還與MDM2還存在一種額外的相互作用(圖7).其氧化吲哚基的C1原子與MDM2表現(xiàn)出疏水作用，MDM2中His96殘基的咪唑側(cè)鏈，通過(guò)氫鍵與SAR405838的羧基相互作用，并且His96與SAR405838的2-氟-3-氯苯基之間也存在π-π重疊.同時(shí)還誘導(dǎo)MDM2氨基末端區(qū)域的非結(jié)構(gòu)性10-18位氨基酸殘基的重新折疊，使這些氨基酸殘基成為結(jié)合區(qū)域的一部分，并進(jìn)一步增加MDM2與SAR405838的親和力[46-47].

圖7 SAR405838與MDM2結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)Fig.7 The crystal structure of SAR405838 bound to MDM2

APG115是我國(guó)自主研發(fā)的、具有高度選擇性的靶向MDM2-p53蛋白相互作用的小分子抑制劑.該化合物與MDM2蛋白結(jié)合的IC50值和Ki值分別為3.8 nmol/L和1 nmol/L.可阻斷MDM2與p53的相互作用并且以p53依賴(lài)性方式誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡，同時(shí)具有很強(qiáng)的細(xì)胞活性和良好的口服藥代動(dòng)力學(xué)特征.在小鼠SJSA-1骨肉瘤異種移植模型的體內(nèi)藥效分析表明，以100 mg/kg口服給藥，連續(xù)14 d有效地實(shí)現(xiàn)了腫瘤的完全和持久的消退.目前，APG115正處于作為單藥及聯(lián)合治療成人復(fù)發(fā)或難治急性髓性白血病(AML)、復(fù)發(fā)或進(jìn)展高危/極高危骨髓增生異常綜合征(MDS)的I期臨床研究[48].

由于MI系列化合物具有較高活性及新穎的作用機(jī)制，RIBEIRO等[49]受此啟發(fā)設(shè)計(jì)合成系列新螺異噁唑啉吲哚衍生物，其中化合物13a-13d對(duì)野生型HepG2細(xì)胞的GI50分別為29.11、35.70、32.84、37.07 μmol/L，顯示出比Nutlin-3(51.31 μmol/L)更強(qiáng)的抗增殖作用，通過(guò)BIFC(雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù))證實(shí)13d對(duì)p53-MDM2相互作用的抑制程度與Nutlin-3相同，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值.WANG等[50]構(gòu)建了以新型螺-四氫噻喃并吲哚為骨架的化合物，其中化合物14a和14b分別表現(xiàn)出良好的結(jié)合親和力，KD值分別為6.36、9.68 μmol/L.分子對(duì)接結(jié)果顯示，化合物14a的羥吲哚部分位于MDM2的Trp23口袋中，并與周?chē)臍埢鵓he91、Ile99、Ile61、Leu57和Phe86形成疏水相互作用，苯環(huán)則嵌入Phe19口袋中，并與Met62、Val93和Ile61形成疏水相互作用，有望成為開(kāi)發(fā)更有效和更具選擇性的p53-MDM2相互作用抑制劑的先導(dǎo)化合物.BARAKAT等[51]報(bào)道了新型取代螺氧吲哚作化合物15可以通過(guò)疏水-疏水相互作用與p53結(jié)合裂隙中的必需氨基酸Leu57、Gly58、Ile61和His96結(jié)合，并抑制集落形成、細(xì)胞遷移，對(duì)HCT116、HepG2、PC-3的抑制活性分別為2、0.85和1.8 μmol/L，阻滯癌細(xì)胞生長(zhǎng)于G2/M期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.此外還可使活化的p53水平升高，并誘導(dǎo)細(xì)胞周期抑制因子p21 mRNA的表達(dá).

新型p53-MDM2抑制劑SAR405838的發(fā)現(xiàn)引起了藥物化學(xué)家們對(duì)螺環(huán)吲哚類(lèi)p53-MDM2抑制劑研究的極大興趣.研究表明，這類(lèi)化合物的吲哚環(huán)能模仿p53的Trp23側(cè)鏈，疏水取代的螺吡咯烷環(huán)能模仿Phe19和Leu26的側(cè)鏈，Leu22對(duì)p53及MDM2的結(jié)合也有著重要的影響[41].目前，在螺環(huán)吲哚類(lèi)化合物中，SAR405838率先針對(duì)未分化脂肪肉瘤(NCT01636479)的患者進(jìn)行I期臨床試驗(yàn).

3.4 異喹啉酮及哌啶酮類(lèi)抑制劑

SUN等[52]應(yīng)用疏水相鄰取代基的剛性支架，模擬占據(jù)MDM2疏水空隙的p53關(guān)鍵殘基，發(fā)現(xiàn)了系列哌啶酮類(lèi)化合物，如圖8所示.其中化合物AM8553與MDM2的結(jié)合常數(shù)KD值為0.4 nmol/L，對(duì)SJSA-1腫瘤細(xì)胞株抑制活性IC50值達(dá)72 nmol/L.結(jié)構(gòu)優(yōu)化后得到化合物AMG232，能高效地抑制p53-MDM2的結(jié)合(KD= 0.045 nmol/L，IC50= 9.1 nmol/L)，在SJSA-1骨肉瘤移植瘤模型中ED50值為9.1 mg/kg，具有顯著的藥動(dòng)學(xué)和體內(nèi)抗腫瘤活性，晶體結(jié)構(gòu)顯示(圖9)，AMG232的對(duì)氯苯基占據(jù)Trp23最深處，間氯苯基進(jìn)入Leu26口袋.后者的相互作用通過(guò)與His96的面對(duì)面π-堆積作用而增強(qiáng)[53]，目前正處于臨床I期研究階段.REW等[54]在AMG232的基礎(chǔ)上用4-氨基苯甲酸取代羧酸得到化合物AM-7209.測(cè)得AM-7209與MDM2的結(jié)合常數(shù)KD達(dá)38 pmol/L.在SJSA-1骨肉瘤異種移植模型及HCT-116結(jié)直腸癌異種移植模型中ED50分別為2.6和10 mg/kg，具有顯著的藥動(dòng)學(xué)特性和體內(nèi)抗腫瘤活性.WANG等[55]在AMG232的基礎(chǔ)上修飾N-烷基取代基，發(fā)現(xiàn)化合物16、17具有與AMG232相似的效力、肝細(xì)胞穩(wěn)定性及藥代動(dòng)力學(xué)特性，通過(guò)均相時(shí)間分辨熒光法測(cè)得IC50值分別為1.1和0.22 nmol/L，可作為先導(dǎo)化合物待進(jìn)一步研究.

圖8 異喹啉酮及哌啶酮類(lèi)p53-MDM2抑制劑Fig.8 Isoquinolines and piperidones derivatives as inhibitors for the p53-MDM2

圖9 AMG232與MDM2結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)Fig.9 Crystal structure of AMG232bound to MDM2

NVP-CGM097[56]是一種新型二氫異喹啉酮類(lèi)MDM2-p53蛋白抑制劑，其IC50值為1.7 nmol/L，在誘導(dǎo)HCT116結(jié)直腸癌野生型p53細(xì)胞系中表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗增殖作用，并顯示出35倍的選擇性.相比缺乏p53的骨肉瘤SAOS-2細(xì)胞系，該化合物以58倍的高選擇性阻斷了HDM2-擴(kuò)增的骨肉瘤SJSA-1細(xì)胞系的增殖.WEISBERG等[57]研究發(fā)現(xiàn)NVP-CGM097以靶標(biāo)特異性方式，有效和選擇性地抑制人AML細(xì)胞系，和大多數(shù)表達(dá)野生型p53但不表達(dá)突變體p53的原代AML細(xì)胞的增殖.與FLT3抑制劑聯(lián)用，可以有效拮抗表達(dá)致癌基因FLT3的細(xì)胞，與MEK抑制劑聯(lián)用可以激活MAPK信號(hào)通路，目前，正處于臨床I期研究.

此后，GESSIER等[58]通過(guò)虛擬篩選發(fā)現(xiàn)二氫異喹啉酮類(lèi)化合物18，通過(guò)TR-FRET生化分析，該化合物能有效為抑制p53-MDM2相互作用，IC50值為0.54 μmol/L，并且在細(xì)胞水平上顯示出微弱的抗增殖活性(16.5 μmol/L).分子對(duì)接結(jié)果顯示，該化合物的二氫異喹啉酮核心與MDM2殘基V93的側(cè)鏈有范德華力作用.雙環(huán)核允許乙氧基和氯苯環(huán)在偽赤道取向上分別占據(jù)TrP23和Phe19子口袋，而甲氧基苯環(huán)與Leu26子袋中的殘基H96，形成芳香族π-π堆積相互作用，氯苯基部分則嵌入Trp23口袋.通過(guò)結(jié)構(gòu)優(yōu)化，得到一系列二氫異喹啉酮類(lèi)化合物，其中化合物19，抑制p53-MDM2相互作用的IC50值為2.3 nmol/L，并在低微摩爾范圍內(nèi)，顯著和特異地抑制了依賴(lài)于p53的SJSA-1細(xì)胞的增殖，為后續(xù)發(fā)現(xiàn)和合成更多高效的二氫異喹啉酮類(lèi)抑制劑提供參考.

4 結(jié)論

p53基因是最廣泛研究的腫瘤抑制基因，p53基因的失活對(duì)腫瘤形成起重要作用，而MDM2是p53的一個(gè)最重要的抑制因子，當(dāng)兩者結(jié)合的時(shí)候，會(huì)使p53蛋白降解，活性降低，抑癌作用減弱.以MDM2-p53為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)全新機(jī)制的抗腫瘤藥物，是當(dāng)下全球腫瘤藥物研發(fā)領(lǐng)域熱點(diǎn)與重點(diǎn)之一.天然產(chǎn)物類(lèi)p53-MDM2抑制劑來(lái)源廣泛，但其在體內(nèi)的有效性、毒性、生物利用度和作用機(jī)制暫不明確.相較而言，小分子類(lèi)p53-MDM2抑制劑研究廣泛，且具有較優(yōu)的活性及生物利用度，因此更具研究?jī)r(jià)值.然而由于MDM2-p53蛋白相互作用的特殊性給小分子抑制劑的開(kāi)發(fā)帶來(lái)相當(dāng)大的困難，導(dǎo)致全球該領(lǐng)域的在研藥物屈指可數(shù).目前靶向作用于p53-MDM2靶點(diǎn)的藥物均處于研發(fā)階段，進(jìn)度較快的有RG-7388(III期)、AMG232(I期)及SAR405838(I期)等.由我國(guó)自主研發(fā)的MDM2-p53的抗腫瘤藥物APG115是國(guó)內(nèi)首個(gè)進(jìn)入臨床的MDM2-p53抑制劑，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)在該靶點(diǎn)藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域內(nèi)的空白，與以上藥物相比，APG115具有顯著的活性和給藥優(yōu)勢(shì)；且可克服前期臨床化合物SAR405838存在慢異構(gòu)化反應(yīng)及中性環(huán)境溶解性差的藥學(xué)缺陷，同時(shí)活性為SAR405838的10倍以上，目前，國(guó)內(nèi)在該領(lǐng)域的在研藥物除APG-115外尚未見(jiàn)有其他報(bào)道.總體而言，p53-MDM2蛋白相互作用已經(jīng)成為治療腫瘤的一個(gè)理想靶點(diǎn)，阻斷p53-MDM2通路，釋放p53蛋白，發(fā)揮其腫瘤抑制功能是一個(gè)有價(jià)值的研究方向.目前，全球針對(duì)該靶點(diǎn)尚未有上市藥物，本文簡(jiǎn)單概述了p53與MDM2的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及不同來(lái)源、不同結(jié)構(gòu)的p53-MDM2抑制劑，旨在為靶向p53-MDM2通路，以及其他新型蛋白-蛋白相互作用的藥物設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)提供思路.