融合魏斯氏菌(Weissella confusa)XG-3產(chǎn)胞外多糖條件研究

劉麗娜，郭尚旭，姜 靜，趙 丹,b,*

(黑龍江大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院微生物省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080；b.農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150500)

0 引 言

乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)是發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，大部分成員是公認(rèn)安全的(generally regarded as safe, GRAS)菌株[1-2]。LAB分泌的多糖類化合物稱為胞外多糖(exopolysaccharide, EPS)。產(chǎn)EPS的LAB在乳桿菌(Lactobacillus)、明串珠菌(Leuconostoc)、乳球菌(Lactococcus)和鏈球菌(Streptococcus)中較為常見(jiàn)，在腸球菌(Enterococcus)、葡萄球菌(Oenococcus)和魏斯氏菌(Weissella)中相對(duì)較少[3]。EPS具有高粘度和優(yōu)良的流變學(xué)特性[4]，可作為天然安全的增稠劑、乳化劑和穩(wěn)定劑，改善食品的質(zhì)地及口感，在食品工業(yè)生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用[5]。此外，EPS還具有抗氧化[6]、抗菌[7]、降膽固醇[8]、免疫調(diào)節(jié)[9]、抗腫瘤[10]及抗病毒[11]等生理功能和生物活性，并已在臨床治療和制藥領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用。

目前，應(yīng)用于生產(chǎn)的LAB EPS的產(chǎn)量普遍較低，使其在工業(yè)生產(chǎn)上受到限制。國(guó)內(nèi)外已有相關(guān)研究表明，EPS的產(chǎn)量不僅與LAB種屬有關(guān)，還受所選培養(yǎng)基組分，培養(yǎng)條件等因素的影響[12-13]。張文平等[14]采用單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)(response surface methodology, RSM)對(duì)植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)產(chǎn)EPS的條件進(jìn)行優(yōu)化，EPS產(chǎn)量增加了48.64%。梁增楠等[15]對(duì)L.plantarumKF5產(chǎn)EPS的條件進(jìn)行單因素及正交試驗(yàn)，EPS的產(chǎn)量增加了26.48%。因此，優(yōu)化培養(yǎng)條件對(duì)提高EPS產(chǎn)量至關(guān)重要，研究結(jié)果可為工業(yè)生產(chǎn)提供依據(jù)。

本文以提高EPS產(chǎn)量為出發(fā)點(diǎn)，以分離自香瓜培養(yǎng)物的融合魏斯氏菌(Weissellaconfusa)XG-3為試驗(yàn)菌株，經(jīng)掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)觀察其顯微形態(tài)，采用單因素試驗(yàn)研究產(chǎn)EPS培養(yǎng)基組分和條件，確定菌株高產(chǎn)EPS的最佳發(fā)酵工藝條件，為菌株工業(yè)化生產(chǎn)EPS提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基與EPS發(fā)酵參數(shù)

供試菌W.confusaXG-3分離自香瓜培養(yǎng)物，保藏于微生物省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(黑龍江大學(xué))。MRS產(chǎn)糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏10，蛋白胨10，葡萄糖50，酵母提取物 5，K2HPO42，C6H5O7(NH4)32，Na2SO30.1，MgSO4·7H2O 0.2，C2H3NaO25，MnSO40.05，Tween80 1 mL，蒸餾水1 L；pH值5.5，121 ℃滅菌15 min。單因素試驗(yàn)中，將W.confusaXG-3制備成108個(gè)/mL細(xì)胞懸液，以2%(v/v)的接種量接入100/250 mL MRS產(chǎn)糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30 ℃、100 rpm振蕩培養(yǎng)36 h。

1.2 主要試劑

苯酚、濃硫酸均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自國(guó)產(chǎn)藥品公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1W.confusaXG-3顯微形態(tài)觀察

采用SEM(S-4800, Hitachi, Japan)觀察W.confusaXG-3顯微形態(tài)。

1.3.2 EPS產(chǎn)量測(cè)定

利用苯酚-硫酸法[16]測(cè)定多糖的產(chǎn)量，具體按照DUBOIS等[17]的方法進(jìn)行操作。以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)線性回歸方程計(jì)算得到EPS產(chǎn)量。

1.3.3W.confusaXG-3生長(zhǎng)量測(cè)定

將W.confusaXG-3發(fā)酵液適當(dāng)稀釋，以相同稀釋倍數(shù)的MRS產(chǎn)糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對(duì)照，測(cè)定發(fā)酵液在600 nm下吸光度值，即為W.confusaXG-3生長(zhǎng)量。

1.3.4 培養(yǎng)基組分對(duì)W.confusaXG-3 EPS產(chǎn)量及生長(zhǎng)量的影響

在MRS產(chǎn)糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別依次考察碳源種類(葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、乳糖和蔗糖)及濃度(葡萄糖50～100 g/L，間隔10 g)對(duì)W.confusaXG-3 EPS產(chǎn)量及生長(zhǎng)量的影響。分別依次考察氮源種類及濃度(牛肉膏、酵母提取物、胰胨和蛋白胨，5～25 g/L，間隔5 g)、乙酸鈉濃度(2～10 g/L，間隔2 g)、檸檬酸銨濃度(2～10 g/L，間隔2 g)、吐溫80濃度(1～5 g/L，間隔1 g)及培養(yǎng)基初始pH值(2.5～8.5，間隔1)對(duì)W.confusaXG-3 EPS產(chǎn)量的影響。

1.3.5 培養(yǎng)條件對(duì)W.confuseXG-3 EPS產(chǎn)量及生長(zhǎng)的影響

在1.3.4優(yōu)化MRS產(chǎn)糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基組分的基礎(chǔ)上，分別依次考察搖床轉(zhuǎn)速(60～180 rpm，間隔30)和溫度(27～39 ℃，間隔3)對(duì)W.confusaXG-3 EPS產(chǎn)量及生長(zhǎng)量的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析方法

本研究所有處理均設(shè)置3個(gè)平行，數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。繪圖軟件為SigmaPlot.10.0。統(tǒng)計(jì)分析軟件為JMP 10.0，組間數(shù)據(jù)多重比較采用Tukey’s方法，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 W.confusa XG-3顯微形態(tài)

SEM顯示(圖1)，W.confusaXG-3細(xì)胞為短桿狀，不產(chǎn)孢子，無(wú)鞭毛，與此前光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果一致，與李巧玉等[18]描述的W.confusa顯微形態(tài)一致。

圖1 W.confusa XG-3顯微形態(tài)掃描電鏡圖(1 000×)Fig.1 SEM showing microscopic morphology of W.confusa XG-3 (1 000×)

2.2 碳源種類及濃度對(duì)W.confusa XG-3 EPS產(chǎn)量及生長(zhǎng)量的影響

碳源是微生物生長(zhǎng)代謝過(guò)程中的必需物質(zhì)，是影響菌株EPS產(chǎn)量及生長(zhǎng)的重要因素之一[19]。本文以葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、乳糖及蔗糖6種常用的碳源進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2，供試碳源對(duì)XG-3 EPS產(chǎn)量及其菌株生長(zhǎng)量有顯著的影響(P<0.001)，EPS產(chǎn)量與生長(zhǎng)量正向相關(guān)。以葡萄糖為碳源時(shí)，EPS產(chǎn)量和菌株生長(zhǎng)量顯著高于其他碳源，產(chǎn)量為15.6 g/L，吸光值為1.36，其次為蔗糖、半乳糖、乳糖、甘露糖和果糖。因此選擇葡萄糖作為W.confusaXG-3合成EPS的最佳碳源。

注：不同字母表示EPS產(chǎn)量間差異顯著，P<0.05。圖2 碳源種類對(duì)W.confusa XG-3 EPS產(chǎn)量及生長(zhǎng)量的影響Fig.2 Effects of carbon source category on EPS production and biomass of W.confusa XG-3

陳媛等[20]報(bào)道食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria)SJ-02產(chǎn)EPS最佳碳源為葡萄糖，與本文結(jié)果一致。陳佳芳等[21]從酒曲中分離出一株W.cibariaT5，對(duì)該菌株所選碳源(葡萄糖、乳糖、蔗糖、半乳糖和果糖)的研究發(fā)現(xiàn)，其產(chǎn)EPS的最佳碳源為蔗糖。上述結(jié)果表明，LAB產(chǎn)EPS的最佳碳源具有種屬特異性，這可能與菌株能量及糖類代謝基因水平的特有基因不同相關(guān)。

葡萄糖添加量對(duì)供試菌生長(zhǎng)及產(chǎn)EPS的影響見(jiàn)圖3。XG-3 EPS產(chǎn)量及生長(zhǎng)量隨葡萄糖添加量的增加而不斷增加，當(dāng)葡萄糖添加量達(dá)到90 g/L時(shí)，XG-3 EPS產(chǎn)量為27.76 g/L，吸光值為1.45。之后隨著葡萄糖添加量增加而降低。葡萄糖濃度對(duì)XG-3 EPS產(chǎn)量及其生長(zhǎng)量有顯著影響(P<0.001)，因此，葡萄糖添加量90 g/L時(shí)為最優(yōu)值。當(dāng)葡萄糖添加量過(guò)低時(shí)，發(fā)酵初期菌株XG-3生長(zhǎng)較快，且初級(jí)代謝產(chǎn)物乙酸積累較少，后期菌株對(duì)葡萄糖的吸收量減少，從而導(dǎo)致EPS合成速率較低。然而，當(dāng)葡萄糖添加量過(guò)高時(shí)，XG-3生長(zhǎng)旺盛，發(fā)酵過(guò)程中發(fā)生“葡萄糖效應(yīng)”導(dǎo)致代謝異常，乙酸等初級(jí)代謝產(chǎn)物大量積累，次級(jí)代謝受到抑制從而影響菌株XG-3的生長(zhǎng)以及EPS的合成。因此，控制合適的葡萄糖添加量對(duì)W.confusaXG-3合成EPS至關(guān)重要。

注：不同字母表示EPS產(chǎn)量間差異顯著，P<0.05。圖3 葡萄糖濃度對(duì)W.confusa XG-3 EPS產(chǎn)量及生長(zhǎng)量的影響Fig.3 Effects of glucose concentration on EPS production and biomass of W.confusa XG-3

2.3 氮源種類及濃度對(duì)W.confusa XG-3 EPS產(chǎn)量的影響

氮源是微生物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，適合的氮源有利于菌體EPS的合成[22]。牛肉膏、酵母提取物、胰胨、蛋白胨4種氮源均對(duì)W.confusaXG-3 EPS的合成起促進(jìn)作用，且隨著氮源添加量的增加，XG-3 EPS的產(chǎn)量均呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)(圖4)。可能的原因是，氮源濃度過(guò)高會(huì)產(chǎn)生滲透脅迫，抑制XG-3 EPS的合成[23-24]。胰胨為10 g/L時(shí)，XG-3 EPS的產(chǎn)量(44.33 g/L)顯著高于其他氮源。不同氮源的種類及添加量對(duì)XG-3 EPS產(chǎn)量差異顯著(P<0.001)。以酵母提取物和胰胨分別為氮源時(shí)，XG-3 EPS的產(chǎn)量差異不顯著，考慮到經(jīng)濟(jì)成本，可選用酵母提取物代替胰胨。Cerning等[25]研究德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)產(chǎn)EPS的影響因素時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以1%的酪蛋白為氮源時(shí)，EPS的產(chǎn)量最高。汪清美等[26]發(fā)現(xiàn)，L.delbrueckiisubsp.bulgaricus產(chǎn)EPS的最佳氮源為4.5%大豆蛋白胨。

注：不同字母表示同種氮源不同濃度EPS產(chǎn)量差異顯著，P<0.05。圖4 氮源對(duì)W.confusa XG-3 EPS產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of nitrogen source on W.confusa XG-3 EPS production

2.4 乙酸鈉、檸檬酸銨、吐溫80和初始pH對(duì)W.confusa XG-3 EPS產(chǎn)量的影響

乙酸鈉、檸檬酸銨、吐溫80的添加量及初始pH均對(duì)W.confusaXG-3 EPS產(chǎn)量有顯著影響(P<0.001)(圖5)。XG-3 EPS的產(chǎn)量均隨著乙酸鈉、檸檬酸銨、吐溫80的添加量及初始pH的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)乙酸鈉的添加量達(dá)到6 g/L時(shí)，XG-3 EPS的產(chǎn)量最高，為46.5 g/L(圖5(a))。檸檬酸銨添加量為5 g/L時(shí)，XG-3 EPS的產(chǎn)量最高，為49.2 g/L(圖5(b))。吐溫80添加量為2 mL時(shí)，XG-3 EPS的產(chǎn)量最高，為51.5 g/L(圖5(c))。初始pH值過(guò)低或過(guò)高都會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng)，pH值過(guò)低菌株生長(zhǎng)的速度減慢，使得EPS的合成量減少，當(dāng)pH值過(guò)高時(shí)，EPS的合成量也會(huì)因?yàn)榫w生長(zhǎng)量的下降而減少。當(dāng)初始pH為4.5和8.5時(shí)，菌株XG-3產(chǎn)EPS水平較低，分別為50.87 g/L和48.9 g/L，當(dāng)初始pH為6.5時(shí)，即弱酸條件下優(yōu)于其他情況，XG-3 EPS產(chǎn)量最高為53.7 g/L(圖5(d))。張文平等[14]對(duì)L.plantarum產(chǎn)EPS的條件進(jìn)行研究，也得到了相同的結(jié)果，即初始pH為6.5時(shí)EPS產(chǎn)量最高。

注：不同字母表示EPS產(chǎn)量差異顯著，P<0.05。圖5 不同因素對(duì)W.confusa XG-3 EPS產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of different factors on W.confusa XG-3 EPS production

2.5 培養(yǎng)條件對(duì)W.confusa XG-3 EPS產(chǎn)量及生長(zhǎng)的影響

搖床轉(zhuǎn)速對(duì)W.confusaXG-3 EPS產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖6，轉(zhuǎn)速對(duì)XG-3 EPS的合成具有顯著的影響(P<0.001)。隨著轉(zhuǎn)速的增加，XG-3 EPS的產(chǎn)量呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到120 rpm時(shí)，XG-3 EPS的產(chǎn)量最高，為58.05 g/L。這可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)速小時(shí)，發(fā)酵液中的溶氧量也隨之降低，菌株XG-3的生長(zhǎng)減慢，進(jìn)而導(dǎo)致EPS的產(chǎn)量降低。當(dāng)轉(zhuǎn)速較大時(shí)，剪切力增加，菌株XG-3的生長(zhǎng)受到抑制，從而導(dǎo)致W.confusaXG-3 EPS的產(chǎn)量降低。

注：不同字母表示EPS產(chǎn)量差異顯著，P<0.05。圖6 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)W.confusa XG-3 EPS產(chǎn)量的影響Fig.6 Effects of rotation speed on W.confusa XG-3 EPS production

培養(yǎng)溫度對(duì)W.confusaXG-3產(chǎn)EPS的影響見(jiàn)圖7，不同溫度對(duì)XG-3 EPS有顯著的差異(P<0.001)。培養(yǎng)溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)抑制菌株XG-3的生長(zhǎng)以及EPS的合成。當(dāng)培養(yǎng)溫度為30～36 ℃時(shí)，XG-3 EPS的產(chǎn)量在58.91 g/L以上，而培養(yǎng)溫度為30 ℃時(shí)，XG-3 EPS的產(chǎn)量最高，為61.03 g/L。當(dāng)溫度上升到39 ℃時(shí)，由于溫度過(guò)高，導(dǎo)致菌株W.confusaXG-3生物量以及EPS產(chǎn)量的下降。馮小婉等[27]對(duì)L.plantarumAR307產(chǎn)EPS的條件進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其最佳溫度為32 ℃時(shí)，EPS的產(chǎn)量最高，與本研究結(jié)果較為相似。

注：不同字母表示EPS產(chǎn)量差異顯著，P<0.05。圖7 溫度對(duì)W.confusa XG-3 EPS產(chǎn)量的影響Fig.7 Effects of temperature on W.confusa XG-3 EPS production

3 結(jié) 論

LAB和EPS的產(chǎn)量受多種因素的影響，且具有種屬特異性。系統(tǒng)研究培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件對(duì)EPS產(chǎn)量的影響，對(duì)于挖掘高產(chǎn)EPS的LAB資源具有重要的意義。本研究結(jié)果表明：當(dāng)培養(yǎng)基中碳源為葡萄糖90 g/L、氮源為酵母提取物10 g/L、乙酸鈉6 g/L、檸檬酸銨5 g/L及吐溫80 2 mL，初始pH為6.5，培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速120 rpm、溫度30 ℃時(shí)，W.confusaXG-3 EPS產(chǎn)量達(dá)到61.03 g/L，比優(yōu)化前提高了44.95%。單因素試驗(yàn)顯著提高了供試菌XG-3 EPS產(chǎn)量，研究結(jié)果為該菌株用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)EPS提供了依據(jù)，具有鮮明的實(shí)踐意義。