樟樹(shù)葉木脂素和多酚超聲輔助同步提取工藝優(yōu)化

周海旭 謝美玉高 晗李 波蘇同超李忠海

(1. 河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2. 中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

樟樹(shù)系樟科樟屬植物，主要分布于中國(guó)的長(zhǎng)江流域及南部區(qū)域[1]。樟樹(shù)是中國(guó)經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的、優(yōu)良的綠化樹(shù)種，具有四季常青、滯留煙塵、凈化空氣、美化環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，可用于園林綠化建設(shè)[2]。除了作為綠化樹(shù)種，樟樹(shù)還是極為珍貴的藥用材料和軍用工業(yè)材料[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究[1]表明，樟樹(shù)具有抑菌、殺蟲(chóng)、抗癌等多種功效。根據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)[4-6]報(bào)道，樟樹(shù)中含有多種活性小分子物質(zhì)。目前學(xué)者們[7-8]已經(jīng)成功從樟樹(shù)葉中獲得多酚類(lèi)物質(zhì)和木脂素類(lèi)物質(zhì)。其中多酚類(lèi)物質(zhì)主要指類(lèi)黃酮、酚酸、木酚素；木脂素類(lèi)物質(zhì)主要是指芝麻素、細(xì)辛脂素等。它們具有多種生物活性，例如抗癌、抗氧化和抑菌等[9-11]，但是目前樟樹(shù)落葉一般歸為垃圾處理，不僅污染環(huán)境，還造成了資源的浪費(fèi)[12]。

對(duì)于木脂素和多酚的提取方法主要有溶劑提取法、微波輔助技術(shù)、超聲波輔助技術(shù)、超臨界技術(shù)、亞臨界技術(shù)。姜少娟等[13]利用超聲波輔助技術(shù)從香樟葉中提取總黃酮，最優(yōu)條件下黃酮提取率為42.35%；張峰[14]采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助酶解提取樟樹(shù)去油枝葉中總多酚，最優(yōu)條件下總多酚提取率均值為22.08 mg/g；袁列江等[15]利用熱回流工藝從樟樹(shù)葉中提取木脂素類(lèi)物質(zhì)，最優(yōu)提取條件下，樟樹(shù)葉木脂素的提取率最大為(43.39±4.91) mg/g。

目前國(guó)內(nèi)外研究[16-19]主要集中于對(duì)樟樹(shù)葉木脂素和多酚單獨(dú)的提取方面，未見(jiàn)對(duì)兩者同步提取的相關(guān)研究。研究擬將超聲波技術(shù)的提取時(shí)間短、提取率高的優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用于同步提取樟樹(shù)葉中木脂素及多酚類(lèi)物質(zhì)，利用超聲波技術(shù)造成的“空洞”現(xiàn)象[20-22]破壞樟樹(shù)葉細(xì)胞壁，改善木脂素及多酚的選擇性從而增加兩者的得率。旨在為樟樹(shù)葉的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供相關(guān)的試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樟樹(shù)葉：2018年9月采自中南林業(yè)科技大學(xué)校內(nèi)，清洗曬干后粉碎以備用；

無(wú)水乙醇、變色酸、濃硫酸、焦性沒(méi)食子酸：分析級(jí)，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)總公司；

五味子酯甲標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，上海源葉生物科技有限公司；

電子天平：GR-202型，上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司；

搖擺式中藥粉碎機(jī)：DFY-500型，溫嶺市大機(jī)械有限公司；

循環(huán)水式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：SHB-Ⅲ型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；

電熱恒溫水浴鍋：HWS26型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：JY92-11型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

紫外分光光度儀：UV1800型，日本島津公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 焦性沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照文獻(xiàn)[23]。

1.2.2 五味子酯甲標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照文獻(xiàn)[24]。

1.2.3 多酚及木脂素得率的計(jì)算

(1) 多酚得率：按式(1)計(jì)算。

(1)

式中：

Y1——多酚得率，mg/g；

m11——多酚粗品中多酚的質(zhì)量，mg；

m12——樣品質(zhì)量，g。

(2) 木脂素得率：按式(2)計(jì)算。

(2)

式中：

Y2——木脂素得率，mg/g；

m21——粗品中木脂素的質(zhì)量，mg；

m22——樣品質(zhì)量，g。

(3) 總得率：按式(3)計(jì)算。

Y=Y1+Y2，

(3)

式中：

Y——總得率，mg/g；

Y1——多酚得率，mg/g；

Y2——木脂素得率，mg/g。

1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1) 料液比對(duì)樟樹(shù)葉多酚及木脂素得率的影響：準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量干燥的樟樹(shù)葉粉末。以超聲波功率300 W，超聲時(shí)間20 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)90%為固定條件，考察料液比(m樟樹(shù)葉∶V乙醇)分別為1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25 (g/mL)時(shí)對(duì)多酚和木脂素得率的影響。

(2) 超聲時(shí)間對(duì)樟樹(shù)葉多酚及木脂素得率的影響：準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量干燥的樟樹(shù)葉粉末。分別以超聲波功率300 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，最優(yōu)料液比為固定條件，考察超聲時(shí)間分別為2，3，4，6，8，10 min時(shí)對(duì)樟樹(shù)葉多酚和木脂素得率的影響。

(3) 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)樟樹(shù)葉多酚及木脂素得率的影響：準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量干燥的樟樹(shù)葉粉末。超聲波功率300 W，最優(yōu)料液比和超聲提取時(shí)間為固定條件，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%，60%，70%，80%，90%，100%時(shí)對(duì)多酚和木脂素得率的影響。

(4) 提取時(shí)間對(duì)樟樹(shù)葉多酚及木脂素得率的影響：準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量干燥的樟樹(shù)葉粉末。以超聲波功率300 W，最優(yōu)料液比、超聲提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)為固定條件，考察提取時(shí)間分別為40，60，80，100，120 min 時(shí)對(duì)多酚和木脂素得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面分析設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert 8.0.5軟件中的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定超聲波輔助提取樟樹(shù)葉木脂素、多酚的最佳工藝條件。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并通過(guò)Origin 8.0作圖；響應(yīng)面試驗(yàn)通過(guò)Design expert 8進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

各因素對(duì)樟樹(shù)葉中木脂素和多酚得率的影響如圖1所示。由圖1可知，最佳的料液比(m樟樹(shù)葉∶V乙醇)為1∶20 (g/mL)；最佳的超聲時(shí)間為4.0 min；最佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%；最佳的提取時(shí)間為80 min。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化分析

2.2.1 試驗(yàn)因素及水平 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以樟樹(shù)葉木脂素、多酚的總得率為響應(yīng)值，分別考察料液比、超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間4個(gè)因素對(duì)總得率的影響。采用Box-Behnken Design中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素及水平取值見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2、3。

2.2.2 回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 通過(guò)Design-Expert 8.0.5軟件對(duì)表3中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸，得到二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=44.48+1.52A-1.02B+0.036C-1.60D+1.37AB-0.87AC-3.18AD+1.05BC-0.73BD-2.30CD-2.97A2-4.94B2-5.01C2-3.26D2。

(4)

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

表1 樟樹(shù)葉木脂素試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

對(duì)所得的回歸擬合方程(4)中的變量分別求一階偏導(dǎo)數(shù)，得到一組二元一次方程組，以得到提取樟樹(shù)葉木脂素、樟樹(shù)葉多酚的最佳料液比、超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間[26]。在此基礎(chǔ)上對(duì)方程組進(jìn)行求解，最終得到提取樟樹(shù)葉木脂素和多酚總得率的最優(yōu)條件為料液比(m樟樹(shù)葉∶V乙醇)1∶22 (g/mL)，超聲時(shí)間3 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，提取時(shí)間78 min，在該條件下總得率的理論最大值達(dá)到93.14 mg/g。

為了檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性，在此最優(yōu)條件下進(jìn)行5次平行實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定樟葉木脂素得率、多酚得率、總得率。經(jīng)測(cè)定木脂素得率為44.89 mg/g；多酚得率為48.17 mg/g；總得率為93.06 mg/g，相對(duì)誤差為0.09%。結(jié)果表明超聲波輔助同步提取樟樹(shù)葉木脂素和多酚工藝條件可行。

2.3 超聲波輔助法與微波輔助法提取效果比較

目前已有研究進(jìn)行了微波法輔助提取樟樹(shù)葉中木脂素[16]和多酚類(lèi)物質(zhì)[17]，現(xiàn)將其與超聲波輔助法進(jìn)行比較，結(jié)果如表4所示。

由表4可知，超聲波輔助提取技術(shù)比微波輔助提取技術(shù)效果好。這是因?yàn)閮烧叩淖饔脵C(jī)理不同：超聲波輔助法主要是利用超聲的空化效應(yīng)、熱效應(yīng)以及機(jī)械效應(yīng)來(lái)破壞樟樹(shù)葉的細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行提?。晃⒉ㄖ饕梅肿娱g的氫鍵斷裂和分子間的碰撞以及破壞細(xì)胞膜進(jìn)行提取[27]。

表2 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)方案及結(jié)果

表3 木脂素得率的ANOVA分析結(jié)果?

圖2 各因素間交互作用對(duì)總得率影響的曲面圖

表4 超聲波輔助同步提取和微波輔助提取樟葉木脂素和多酚的比較?

3 結(jié)論

研究利用超聲波輔助同步提取樟樹(shù)落葉中的木脂素及多酚，使用響應(yīng)面法優(yōu)化及分析，最終確定最佳值為料液比(m樟樹(shù)葉∶V乙醇)1∶22 (g/mL)，超聲時(shí)間3 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，提取時(shí)間78 min，在此條件下木脂素和多酚得率預(yù)測(cè)值分別為44.89，48.17 mg/g。超聲波輔助同步提取樟葉木脂素和多酚法具有提取溶劑少，提取效率高、可以有效降低單個(gè)活性的提取成本的特點(diǎn)；同時(shí)木脂素、多酚的提取使得樟樹(shù)葉變費(fèi)為寶，利于環(huán)境的保護(hù)，降低環(huán)境污染。