液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測唾液皮質(zhì)醇和可的松進(jìn)展及臨床應(yīng)用

陸優(yōu)麗，龔曉霖，李水軍

(1.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院&復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院徐匯醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海 200031;2.上海市臨床檢驗(yàn)中心，上海 200126)

皮質(zhì)醇作為腎上腺分泌的主要糖皮質(zhì)激素，在調(diào)節(jié)情緒和健康、維持免疫細(xì)胞和炎癥、血管和血壓之間的聯(lián)系，以及維護(hù)結(jié)締組織等方面具有重要功能。根據(jù)臨床診斷、科學(xué)研究、運(yùn)動(dòng)員興奮劑篩查等檢測目的不同，可對(duì)全血、血漿、血清、尿液、唾液、毛發(fā)等生物基質(zhì)樣本中的皮質(zhì)醇進(jìn)行檢測，其中血清、尿液或唾液可用于評(píng)價(jià)下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)功能[1-3]。皮質(zhì)醇是親脂性分子，經(jīng)腺泡細(xì)胞被動(dòng)擴(kuò)散至唾液中，這一過程不受唾液分泌的影響[4]。唾液皮質(zhì)醇與血清游離皮質(zhì)醇水平相關(guān)，可代表人體內(nèi)生物活性的皮質(zhì)醇水平[5]?？傻乃墒瞧べ|(zhì)醇在唾液中的代謝產(chǎn)物，由唾液腺中的11β-羥基類固醇脫氫酶Ⅱ型(11β-hydroxysteroid dehydrogenase 2，11βHSD2)催化而來，二者生理節(jié)律及化學(xué)結(jié)構(gòu)相似。在唾液中可的松濃度高于皮質(zhì)醇，且比值波動(dòng)較小，因此，可的松不僅是干擾皮質(zhì)醇檢測的一個(gè)重要因素，同時(shí)可的松的檢測也可用于判斷外源性皮質(zhì)醇(氫化可的松)污染所帶來的假陽性結(jié)果[6]。

唾液采集較血液采集的優(yōu)勢明顯，如無創(chuàng)、簡單、且不受樣本采集時(shí)間和地點(diǎn)的限制，可以連續(xù)多次采集，更容易被患者所接受等，因此，唾液皮質(zhì)醇是血液皮質(zhì)醇合適的替代指標(biāo)。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)可準(zhǔn)確檢出唾液中較低濃度的皮質(zhì)醇，可應(yīng)用于相關(guān)疾病的臨床診斷及科學(xué)研究。本文從唾液皮質(zhì)醇的臨床應(yīng)用和LC-MS/MS檢測技術(shù)進(jìn)展兩方面闡述國內(nèi)外該領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀，并進(jìn)行展望。

1 唾液皮質(zhì)醇檢測的臨床應(yīng)用

1.1唾液檢測的優(yōu)勢 采用唾液樣本檢測皮質(zhì)醇，具有無創(chuàng)、可操作性強(qiáng)、適合于連續(xù)采樣等優(yōu)勢，更重要的是，唾液皮質(zhì)醇及可的松水平與血清皮質(zhì)醇水平相關(guān)性好，即使皮質(zhì)醇結(jié)合球蛋白(CBG)異常也不受干擾，反映體內(nèi)生物活性部分的激素水平[7]。近年來開展的唾液皮質(zhì)醇相關(guān)的主要臨床研究方向和進(jìn)展均采用LC-MS/MS技術(shù)，其中不少研究都使用了唾液皮質(zhì)醇和可的松同時(shí)檢測的方法。

1.2作為庫欣綜合征的一線篩查指標(biāo) 庫欣綜合征，又稱皮質(zhì)醇增多癥，是由于多種原因引起的腎上腺皮質(zhì)長期分泌過多的糖皮質(zhì)激素所產(chǎn)生的臨床癥候群。雖有典型的臨床特征，其鑒別診斷仍需依靠實(shí)驗(yàn)室檢查，體內(nèi)皮質(zhì)醇升高是其最主要的生化診斷依據(jù)。經(jīng)過多年的臨床研究，午夜唾液皮質(zhì)醇水平作為庫欣綜合征的實(shí)驗(yàn)室一線篩查指標(biāo)已得到國際認(rèn)可，其診斷的特異性和敏感性均優(yōu)于血液和尿液中皮質(zhì)醇的檢測[8-9]?？傻乃勺鳛榕懦蓴_和外源性污染的輔助診斷方法，也已得到了多數(shù)研究者的認(rèn)可。唾液中的皮質(zhì)醇和可的松存在晝夜節(jié)律，一般早晨達(dá)峰值(皮質(zhì)醇：3.0～21.0 nmol/L，可的松：10.4～42.2 nmol/L，皮質(zhì)醇/可的松比值：0.17～0.57)，隨后逐漸下降，至午夜可降至最低(皮質(zhì)醇：0.5～2.5 nmol/L，可的松：1.5～13.0 nmol/L，皮質(zhì)醇/可的松比值：0.09～0.037)[6]。

此外，亞臨床庫欣綜合征被定義為無典型臨床癥狀的皮質(zhì)醇增多癥，這類患者比典型患者的發(fā)病率更高，也更容易被忽視。研究認(rèn)為，臨床需結(jié)合午夜唾液皮質(zhì)醇水平和1 mg地塞米松抑制試驗(yàn)確診這類患者[10]。

1.3腎上腺疾病的診斷和治療評(píng)價(jià) 除了庫欣綜合征的術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測，唾液皮質(zhì)醇也可用于腎上腺皮質(zhì)功能減退癥(又稱艾迪森病，簡稱AI)患者的診斷及治療監(jiān)測[11-13]。該病由各種原因引起的皮質(zhì)醇分泌減少所致，一般通過檢測體內(nèi)皮質(zhì)醇水平的減少從而進(jìn)行生化診斷。研究顯示，當(dāng)AI患者進(jìn)行靜脈注射或口服氫化可的松(即皮質(zhì)醇)替代治療時(shí)，唾液可的松與血清游離皮質(zhì)醇水平的相關(guān)性更高，可能作為簡便、經(jīng)濟(jì)的AI治療監(jiān)測手段[14]。例如使用米托坦治療腎上腺皮質(zhì)癌時(shí)也可出現(xiàn)AI癥狀，血清皮質(zhì)類固醇載體蛋白(CBG)升高，皮質(zhì)醇水平被抑制，需使用氫化可的松替代治療。采用免疫法檢測血清皮質(zhì)醇水平無法正確估算激素替代治療的劑量，而利用LC-MS/MS技術(shù)檢測唾液皮質(zhì)醇和可的松水平，在排除干擾的同時(shí)，還可檢測生物活性的皮質(zhì)醇水平，能真正有效指導(dǎo)臨床用藥[15]。

唾液皮質(zhì)醇還可用于HPA軸功能的評(píng)價(jià)，一項(xiàng)功能評(píng)價(jià)研究發(fā)現(xiàn)，患者行二十四肽促皮質(zhì)素刺激試驗(yàn)(SST)后，HPA軸功能正常的患者唾液皮質(zhì)醇水平升高較血清皮質(zhì)醇更顯著，二者呈現(xiàn)指數(shù)關(guān)系[16]，唾液皮質(zhì)醇檢測HPA軸功能異常的特異性和敏感性均為100%。

盡管唾液皮質(zhì)醇在相關(guān)疾病領(lǐng)域的研究已得到眾多專家的肯定，仍有一些報(bào)道認(rèn)為唾液皮質(zhì)醇和可的松用于AI的診斷和激素替代治療的相關(guān)性證據(jù)不足[17]。激素替代治療組中皮質(zhì)醇和可的松波動(dòng)以及個(gè)體間差異均較大，到底是指標(biāo)的特異性較差，還是存在患者依從性等不可控因素，仍有待進(jìn)一步研究。

1.4其他疾病和研究的應(yīng)用 皮質(zhì)醇作為應(yīng)激激素，參與機(jī)體的多種生理調(diào)節(jié)，并與情緒、認(rèn)知等有關(guān)。研究表明，抑郁癥患者早晨唾液皮質(zhì)醇水平較健康人升高，唾液皮質(zhì)醇檢測可能有助于抑郁癥的診斷或病情觀察[18]。有學(xué)者認(rèn)為皮質(zhì)醇水平也可在一定程度上反映人體的疲勞狀況，例如慢性疲勞綜合征患者唾液皮質(zhì)醇和可的松水平較健康對(duì)照人群顯著降低[19]。

2 唾液皮質(zhì)醇檢測技術(shù)

2.1傳統(tǒng)檢測技術(shù) 免疫法、電化學(xué)法、熒光法等技術(shù)是目前唾液皮質(zhì)醇臨床研究的主要檢測手段[20-22]，然而，這些方法的特異性較差，無法區(qū)分內(nèi)源性和外源性糖皮質(zhì)激素的交叉干擾。此外，檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化的缺乏使得不同實(shí)驗(yàn)室間的檢測結(jié)果無法直接比對(duì)[23-24]。導(dǎo)致這些技術(shù)存在明顯缺陷的原因是， 11βHSD2的表達(dá)使得唾液腺中可的松/皮質(zhì)醇的比值明顯高于血清，免疫法無法區(qū)分結(jié)構(gòu)相似的皮質(zhì)醇和可的松。此外，皮質(zhì)醇作為節(jié)律變化的應(yīng)激激素，一天中正常節(jié)律為午夜最低，午夜是靈敏診斷疾病的最佳時(shí)間點(diǎn)。但對(duì)于免疫法來說，由于午夜唾液皮質(zhì)醇水平較低，檢測準(zhǔn)確性是一個(gè)極大的挑戰(zhàn)[25]。

2.2LC-MS/MS檢測技術(shù) LC-MS/MS是通過化合物的極性、質(zhì)荷比及其結(jié)構(gòu)所包含的特征碎片的不同將目標(biāo)化合物與其干擾成分相互分離，最終實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定量的一項(xiàng)技術(shù)，其作為檢測小分子激素的金標(biāo)準(zhǔn)，常被用于建立激素的參考方法[26]。表1列舉了近年來使用LC-MS/MS技術(shù)的唾液皮質(zhì)醇檢測方法[6-7,27-38]。為了滿足唾液中低水平皮質(zhì)醇的檢出，上述方法多使用了樣品濃縮技術(shù)，包括液液提取法[7,28-29]，沉淀后蒸發(fā)法[27, 30]，固相萃取法[6,31-33]，蛋白質(zhì)加熱變性后在線毛細(xì)管固相微萃取法[34-35]等，其中固相萃取又分為在線和離線技術(shù)，離線法處理步驟復(fù)雜，耗時(shí)較多，在線法樣品處理簡單，自動(dòng)化水平較高。與之類似的還有Turboflow技術(shù)[36]，同樣只需簡單的樣品預(yù)處理。

表1 唾液皮質(zhì)醇LC-MS/MS檢測方法

2.3LC-MS/MS法檢測優(yōu)勢 LC-MS/MS技術(shù)檢測唾液皮質(zhì)醇的一個(gè)突出優(yōu)勢在于其敏感性高，這使得準(zhǔn)確檢測低濃度的唾液皮質(zhì)醇成為現(xiàn)實(shí)。相較于免疫法，LC-MS/MS方法的線性更寬，定量限更低，最低可達(dá)0.05 ng/mL[34]，特別是在低濃度樣本檢測時(shí)顯著優(yōu)于免疫法。LC-MS/MS技術(shù)的另一大優(yōu)勢在于抗干擾能力強(qiáng)、特異性好，液相色譜法可使得皮質(zhì)醇與可的松、6β-羥基可的松、21-脫氧皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮等在免疫法中產(chǎn)生干擾的甾體激素獲得色譜的基線分離，因此LC-MS/MS技術(shù)是目前抗干擾能力最強(qiáng)的檢測方法[15]。唾液較血清相比，成分簡單，皮質(zhì)醇和可的松從唾液中的提取相對(duì)簡便，提取回收率可達(dá)60%以上，且無明顯的基質(zhì)效應(yīng)(表1)。二者不僅可以區(qū)分結(jié)構(gòu)，也可以實(shí)現(xiàn)皮質(zhì)醇和可的松的同時(shí)檢測，并且二者之間無相互干擾?？傻乃勺鳛橥僖合僦?1βHSD2催化皮質(zhì)醇的代謝物，可以排除外源性糖皮質(zhì)激素污染所帶來的假陽性結(jié)果[39]。當(dāng)患者使用糖皮質(zhì)激素進(jìn)行替代治療時(shí)，可的松與血清皮質(zhì)醇的相關(guān)性優(yōu)于唾液皮質(zhì)醇，可用于療效的監(jiān)測[40-41]。

3 應(yīng)用前景與挑戰(zhàn)

檢測唾液中皮質(zhì)醇和可的松是一項(xiàng)無創(chuàng)、采樣簡便的技術(shù)，不受時(shí)間地點(diǎn)的限制，患者的依從性好。相較于免疫法，LC-MS/MS法檢測唾液皮質(zhì)醇的準(zhǔn)確性和特異性更高，線性范圍、敏感性和抗干擾能力更強(qiáng)。這項(xiàng)技術(shù)在國外已被廣泛應(yīng)用于臨床診斷和科學(xué)研究中，在國內(nèi)近年來也逐步得到發(fā)展和應(yīng)用。在庫欣綜合征術(shù)后監(jiān)測和激素替代治療方面，唾液皮質(zhì)醇和可的松的檢測具有血清、尿液無法比擬的優(yōu)勢，在健康篩查、大規(guī)模人群研究中也比較適用。由于國內(nèi)臨床LC-MS/MS技術(shù)起步較晚，目前缺乏基于我國人群的健康參考區(qū)間數(shù)據(jù)。因此，開發(fā)和驗(yàn)證唾液皮質(zhì)醇的LC-MS/MS檢測方法，建立國內(nèi)人群的健康參考區(qū)間和疾病判斷值是亟需解決的首要問題。在此基礎(chǔ)上開展相關(guān)的臨床研究和應(yīng)用探索，將會(huì)讓臨床醫(yī)生更加了解唾液皮質(zhì)醇的臨床價(jià)值和適用范圍，從而使LC-MS/MS技術(shù)和唾液皮質(zhì)醇檢測項(xiàng)目更好地服務(wù)于臨床。