甲狀腺相關(guān)眼病患者眼眶脂肪組織中AdPLA基因及IGF-1的表達研究

近年來，流行病學(xué)顯示[1]，我國甲狀腺相關(guān)眼病(thyroid-associated ophthalmopathy，TAO)的發(fā)病率呈逐步增高趨勢?；颊叨啾憩F(xiàn)為眼球突出、眼瞼腫脹退縮、上瞼遲滯、結(jié)膜充血水腫、限制性眼外肌病變等癥狀，嚴(yán)重者可致患者失明[2]。根據(jù)患者的病理表現(xiàn)其主要是因眼眶內(nèi)脂肪組織增多和眼外肌肥厚纖維化以及炎性病變而發(fā)病[3]，其中眶內(nèi)脂肪組織增多是誘導(dǎo)TAO發(fā)病的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長因子(insulin-likegrowth factor-1,IGF-1)是主要的炎性因子，其表達水平在診斷TAO病患者中發(fā)揮重要作用[4]，但TAO患者外周血中以及眼眶脂肪組織中IGF-1含量是否增加現(xiàn)無明確定論。同時研究顯示[5]，TAO患者眼眶脂肪細胞內(nèi)脂肪生成加速，但很少有對眼眶脂肪水解方面研究的關(guān)注，而脂肪特異性磷脂酶(adipose-specife phospholipase A,AdPLA)是最重要的脂肪水解調(diào)控因子。故本研究探討了TAO患者眼眶脂肪組織中AdPLA及IGF-1的表達，以分析AdPLA及IGF-1在TAO發(fā)病機制中的作用。

資料與方法

一、一般資料

選取我院2016 年8月至2018 年3月收治的50例TAO患者納入研究。入選標(biāo)準(zhǔn)：①影像學(xué)檢查顯示雙眼多條眼外肌表現(xiàn)為肌腹肥厚[6]；②眼眶CT顯示單側(cè)或雙側(cè)眼球突出，眼眶脂肪增多，眼外肌無肥大或肌腹輕度肥大；③甲狀腺功能障礙或者有甲亢病史；④臨床活動性評分(CAS)<4分；⑤首次發(fā)病，病程≤6個月。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他眼眶疾病者；②凝血功能障礙者；③伴惡性腫瘤、內(nèi)分泌系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)疾病或嚴(yán)重臟器功能障礙；④拒絕參與本研究。其中男性20例，女性30例，患者年齡19～69歲，平均(52.26±4.83)歲，病程(0.25±0.06)年。并取同期50例眼部整形手術(shù)者納入對照組，男性18例，女性32例，年齡18～69歲，平均(51.87±5.62)歲。所有入組對象均對研究知情，并且簽署知情同意書。

二、方法

1.主要儀器與試劑：Western Blot電泳儀(Midi-96型)，美國Thmorgan公司，離心機(Eppendorf5702型)，德國Eppendorf公司，RT-PCR儀(C1000 Touch型)，美國Bio-Rad公司，IFP全自動酶標(biāo)儀(TR2100C)，德國IFP公司。RNA抽提試劑盒(RNAiso Plus，TAKARA，Cat．No．9108)，Perfect Real Time試劑盒(PrimeScriptTM RT Master Mix，TAKARA，Cat．No．RR036A)；兔抗人IGF-1多克隆抗體(英國Abcam公司)；免疫組織化學(xué)檢測試劑盒(上?；蚩萍加邢薰?；IGF-1 ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)。

2.IGF-1蛋白的檢測：收集兩組患者眼眶脂肪組織標(biāo)本中，每個標(biāo)本分成兩部分，一部分經(jīng)10%甲醛固定24 h，石蠟包埋，厚5 μm連續(xù)切片，行蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。另一部分標(biāo)本制備切片行常規(guī)免疫組織化學(xué)檢測，常規(guī)脫蠟、水化組織切片，pH 6.0的枸櫞酸鈉修復(fù)液95 ℃水浴修復(fù)40 min，阻斷過氧化物酶后PBS沖洗3次，避光孵育15 min，分別于滴加一抗，PBS再沖洗3次，37 ℃孵育45 min，二抗系統(tǒng)處理經(jīng)DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水并封片。400倍光學(xué)顯微鏡下觀察組織中IGF-1蛋白的表達，以細胞核、細胞膜和細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕褐色染色為陽性反應(yīng)，計數(shù)5個視野中細胞著色程度及著色細胞比例。參考文獻確定陽性反應(yīng)，并記錄2個組中強陽性例數(shù)。

三、AdPLA mRNA表達

(1)RNA提取：用RNA抽提試劑盒進行RNA提取，操作按照說明書進行；(2)反轉(zhuǎn)錄：將1 μg抽提的RNA用Perfect Real Time試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。將提取的RNA用DEPC水吹起(共8 μl)，加入2 μl 5×PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物，置于37 ℃水浴15 min，85 ℃水浴5 s，然后快速冰浴。(3)PCR：以cDNA為模板進行PCR反應(yīng)來定量檢測AdPLA mRNA的表達水平。通過細胞內(nèi)參照基因(GAPDH)取得常態(tài)目標(biāo)值，以確定mRNA的表達水平。AdPLA及GAPDH引物見表1。

表1 AdPLA及GAPDH引物序列

四、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、兩組患者眼球突出度及眼眶脂肪量比較

TAO組患者眼球突出度、眼眶脂肪量均明顯多于對照組(P<0.01)。見表2。

表2 兩組患者眼球突出度及眼眶脂肪量比較

二、兩組患者眼眶脂肪組織中IGF-1表達

TAO組IGF-l主要在脂肪細胞的細胞膜及細胞質(zhì)中呈現(xiàn)棕褐色表達；對照組呈淡棕色染色。TAO組眼眶脂肪細胞中IGF-1的強陽性表達率明顯高于對照組(P<0.05)。見表3，圖1。

表3 兩組患者眼眶脂肪組織中IGF-1表達

三、兩組患者眼眶脂肪組織中AdPLa基因的表達

TAO患者眼眶脂肪組織中AdPLA mRNA表達量明顯高于對照組(P<0.05)。見表4。

表4 兩組患者眼眶脂肪組織中AdPLA基因的表達

討 論

一、TAO的組織病理學(xué)特點

TAO屬于自身免疫性的眼病，表現(xiàn)為眼眶炎性改變，誘發(fā)患者雙眼或單眼突出，其主要病理過程為眼眶脂肪增生、炎性反應(yīng)以及糖胺聚糖(GAG)沉積[7，8]。研究顯示[9]，眼眶成纖維細胞在多因素刺激下被自身反應(yīng)性T淋巴細胞和B淋巴細胞識別，引起自身免疫反應(yīng)。導(dǎo)致大量炎性因子在眼眶組織中聚集，促使眼眶成纖維細胞增生并分泌大量GAG并結(jié)合大量水分，從而誘發(fā)眼眶脂肪組織和眼外肌間質(zhì)水腫[10]；同時眼眶成纖維細胞增生分化為脂肪細胞，進而形成TAO的特異性表現(xiàn)[11]。本研究結(jié)果顯示，TAO組患者眼球突出度、眼眶脂肪量均明顯多于對照組(P<0.01)。與上述報道結(jié)果相似。

二、IGF-1在TAO形成中的作用

IGF-1是多種疾病的炎性標(biāo)志因子，呈現(xiàn)高表達。本研究結(jié)果顯示，TAO組眼眶脂肪細胞中IGF-1的強陽性表達率明顯高于標(biāo)本對照組(P<0.05)。這與王鈺嬌等[12]研究結(jié)果一致?？赡艿脑驗椋篒GF-1可特異性地與IGF-1R結(jié)合并活化P13K信號通路，上調(diào)過氧化物酶體增生物激活受體y(PPAR7)，促進T淋巴細胞趨化因子白細胞介素-16和受激活調(diào)節(jié)正常T細胞表達和分泌因子(RANTES)的表達，引發(fā)全身免疫反應(yīng)[13-15]，大量炎性因子知道為什么，量增生，釋放大量炎性介質(zhì)，眼眶成纖維細胞被激活，促進脂肪生成及分泌大量GAG[5]，從而誘發(fā)TAO。同時本研究結(jié)果顯示，TAO組患者脂肪細胞的細胞膜及細胞質(zhì)中可見IGF-1棕褐色染色，而對照組呈現(xiàn)淡棕色染色，表明IGF-1在TAO患者眼眶脂肪組織呈現(xiàn)高表達，可能參與了脂肪細胞增生及成熟的整個過程。

三、AsPLA在TAO形成中的作用

眼眶脂肪組織增生是TAO患者的最主要病理過程，主要表現(xiàn)為脂肪細胞數(shù)量的增多和脂肪細胞體積的增大。大量研究顯示，TAO患者眼眶脂肪細胞的生成加快，如通過抑郁脂肪生成來改善疾病只能抑制新的脂肪細胞的增加，對于已經(jīng)生成的眼眶脂肪組織則無作用，易導(dǎo)致已生成的組織過多堆積。而筆者經(jīng)過多年的臨床經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)，除了抑制新生的脂肪組織外，加速眼眶脂肪水解則可有效解決已存在的脂肪組織的堆積，使脂肪細胞內(nèi)的甘油三酯水解成游離脂肪酸(FFA)和甘油，釋放循環(huán)中，從而更有利于改善眼球突出。脂肪水解的過程受很多內(nèi)分泌因子和激素的調(diào)控[16]，AdPLA是其中最重要的自分泌和旁分泌的脂肪水解調(diào)控因子，它水解磷脂的sn-2位產(chǎn)生花生四烯酸(AA)和FFA，AA通過環(huán)氧合酶(cox)產(chǎn)生前列腺素E2(PGE2)，后者與脂肪細胞表面的Gai偶聯(lián)的前列腺素受體3(EP3)相結(jié)合，抑制腺苷酸環(huán)化酶而抑制脂肪水解。研究表明[17]，AdPLA-缺陷小鼠出現(xiàn)了無限制性的全身脂肪水解。

本研究證實，TAO患者眼眶脂肪組織中AdPLA mRNA的表達量明顯高于對照組。我們推測，AdPLA的高表達使得TAO眼眶脂肪水解減少，從而加重了眼眶脂肪的堆積和眼球突出。所以，利用脂肪水解原理，采用RNA干擾技術(shù)沉默眼眶脂肪AdPLA基因來促進眼眶脂肪水解，可能為TAO患者提供一條非手術(shù)的治療方法。 綜上所述，TAO患者眼眶脂肪組織中AdPLA基因及IGF-1表達均增加，二者可作為早期診斷TAO的指標(biāo)，但具體是什么原因?qū)е翧dPLA基因及IGF-1表達升高，尚需進一步研究。