單皰病毒性角膜炎患兒淚液MMP-2、MMP-9表達(dá)與預(yù)后復(fù)發(fā)相關(guān)性研究

索倩 張德勇 郭寶 孫莉 張波 陳藝林 蔡文茜

因抗生素的應(yīng)用，細(xì)菌性角膜炎已得到有效控制，目前眼科常見角膜炎多為病毒性，特別是單皰病毒性角膜炎[1]。單皰病毒性角膜炎主要分為感染性角膜炎、神經(jīng)營養(yǎng)性角膜炎、基質(zhì)型角膜炎、內(nèi)皮型角膜炎4種類型，它是常見的危害視力的病毒性眼病，其患病率和致盲率均占角膜病首位，且具有較高的復(fù)發(fā)率[2，3]。因此，臨床上急需尋找單皰病毒性角膜炎預(yù)后相關(guān)因子，以便及時預(yù)測、合理治療，降低疾病復(fù)發(fā)率。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)是一類鋅蛋白酶，可分解細(xì)胞外基質(zhì)組分，在有機(jī)體生長發(fā)育中逆轉(zhuǎn)和重塑，且在疾病的病理損害中起著重要的作用[4]。有報道表明，MMP-2、MMP-9等多種MMPs在翼狀胬肉中表達(dá)增高，高表達(dá)的MMPs 溶解鮑曼氏層，使翼狀胬肉血管化侵襲角膜[5]。Schargus等[6]探討和評價了MMP-9的測定對干眼癥及其亞型的診斷價值。各報道均表明MMP-2、MMP-9與眼部疾病有密切聯(lián)系，但很少有二者在單皰病毒性角膜炎中的相關(guān)報道。因此，本研究通過檢測單皰病毒性角膜炎患兒淚液中MMP-2、MMP-9表達(dá)水平，探討MMP-2、MMP-9在預(yù)測單皰病毒性角膜炎患兒預(yù)后復(fù)發(fā)中的應(yīng)用價值。以期為開發(fā)單皰病毒性角膜炎預(yù)后復(fù)發(fā)預(yù)測指標(biāo)開辟新思路，同時配合積極治療降低復(fù)發(fā)率。

資料與方法

一、一般資料

選取2016年5月至2018年6月于本院接受治療的80例單皰病毒性角膜炎患兒(包括感染性角膜炎28例、神經(jīng)營養(yǎng)性角膜炎22例、基質(zhì)型角膜炎16例、內(nèi)皮型角膜炎14例)為研究對象(角膜炎組)，其中右眼32例，左眼37例，雙眼11例，共91只眼，年齡1～11歲，平均(6.17±2.06)歲；男性43例，女性37例；同期選取76例(76只眼)因淚液分泌過多行淚液檢查未發(fā)生角膜炎兒童作為對照(對照組)，年齡1～10歲，平均(5.82±1.83)歲；男性39例，女性37例。兩組兒童年齡、性別資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。80例單皰病毒性角膜炎患兒根據(jù)各自病理分型及病情程度采取不同治療方法，最終均治愈，自覺癥狀消失，視力提高，但其中30例在隨訪1年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)，根據(jù)病情有無復(fù)發(fā)將單皰病毒性角膜炎患兒分為復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組。本研究中所有患兒均由主治醫(yī)師明確診斷，本試驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院臨床研究倫理委員會批準(zhǔn)，符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，所有受試對象家人均由專業(yè)人員詳細(xì)告知研究內(nèi)容并自愿參加，同時簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①患兒病情均符合角膜炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，由臨床癥狀判斷、實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢查等確診，單皰病毒性角膜炎分類參照Holland等提出的分類法[8]；②隨訪完成；③無其它眼部疾病者；④病理資料齊全者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙患兒；②伴有全身系統(tǒng)性疾病與惡性腫瘤患兒；③過敏性體質(zhì)或合并嚴(yán)重中性粒細(xì)胞減少患兒；④其它因素所致難以順利完成本研究患兒。

二、主要試劑與儀器

MMP-2 ELISA試劑盒(貨號：HH-32-1)，購自上海傳秋生物科技有限公司；MMP-9 ELISA試劑盒(貨號：ARB11575)，購自北京百奧萊博科技有限公司。PT-3502C型全波長酶標(biāo)儀，購自北京普天新橋技術(shù)有限公司。

三、研究方法

1.樣品采集及保存：所有受試對象均于下午2～4時收集淚液。使用20 μl微量吸管于下穹隆部取結(jié)膜囊內(nèi)淚液60～100 μl，置于0.5 ml塑料管中(經(jīng)去離子水處理)，加熱后封閉管口，置于～20℃保存待測。

2.淚液中MMP-2、MMP-9水平測定：采用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測淚液中MMP-2、MMP-9水平，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、兩組淚液中MMP-2、MMP-9水平比較

角膜炎組淚液中MMP-2、MMP-9水平顯著高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組淚液中MMP-2、MMP-9水平比較

二、不同類型角膜炎患者淚液中MMP-2、MMP-9水平比較

各角膜炎患者淚液中MMP-2、MMP-9水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各角膜炎患者淚液中MMP-2、MMP-9水平比較

三、治療后復(fù)發(fā)患兒與未復(fù)發(fā)患兒淚液MMP-2、MMP-9水平比較

復(fù)發(fā)組淚液中MMP-2、MMP-9水平顯著高于未復(fù)發(fā)組(P<0.05)。見表3。

表3 治療后復(fù)發(fā)患兒與未復(fù)發(fā)患兒MMP-2、MMP-9水平比較

四、單皰病毒性角膜炎患兒治療后復(fù)發(fā)患兒淚液MMP-2、MMP-9水平相關(guān)性

Pearson法分析單皰病毒性角膜炎患兒治療后復(fù)發(fā)患兒淚液中MMP-2、MMP-9水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示，MMP-2、MMP-9水平呈正相關(guān)(r=0.675，P<0.05)。見圖1。

五、淚液MMP-2、MMP-9對單皰病毒性角膜炎治療后復(fù)發(fā)的診斷價值

分別以淚液MMP-2、MMP-9單個指標(biāo)及二者聯(lián)合預(yù)測值為檢驗(yàn)變量繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，淚液MMP-2、MMP-9診斷單皰病毒性角膜炎治療后復(fù)發(fā)的曲線下面積(area under curve，AUC)分別為0.788(95%CI:0.677～0.899)、0.873(95%CI:0.785～0.961)，截?cái)嘀捣謩e為0.714 ng/ml、1.081 mg/l，特異性分別為88.0%、82.0%，敏感度分別為66.7%、83.3%；二者聯(lián)合診斷單皰病毒性角膜炎治療后復(fù)發(fā)的AUC為0.916(95%CI:0.835～0.997)，特異性為90.0%，敏感度為83.3%。見圖2。

討 論

單純皰疹病毒角膜炎的感染一般分為兩種形式：原發(fā)性感染和復(fù)發(fā)性感染，其中原發(fā)性感染多見于基本無免疫力的兒童，復(fù)發(fā)性感染多見于血清中已有中和抗體、曾有過病毒感染者[9]。單皰病毒性角膜炎起病急、病程長，對視力損害較大，是臨床中常見致盲性眼部疾病。治療后反復(fù)發(fā)作是單皰病毒性角膜炎致盲的主要原因，也是目前臨床醫(yī)師研究的重難點(diǎn)問題，而有關(guān)單皰病毒性角膜炎復(fù)發(fā)的具體機(jī)制仍不十分清楚，且缺乏特異性診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]。因此，臨床上急需尋找單皰病毒性角膜炎復(fù)發(fā)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，以便為臨床治療提供指導(dǎo)意見。

MMP家族包括MMP及其抑制劑，其中MMP是一組蛋白水解酶，可降解細(xì)胞外基質(zhì)，其抑制劑可抑制其活性[11]。細(xì)胞外基質(zhì)MMP誘導(dǎo)因子在人類各種腫瘤細(xì)胞中廣泛存在，主要作用為刺激與腫瘤有關(guān)的成纖維細(xì)胞合成增加[12]。MMP與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、葡萄膜黑色素瘤等眼腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系[13]。MMPs根據(jù)作用底物不同，可以分為五種亞型：明膠酶(MMP-2，MMP-9)、膜型MMPs(MMP-14，MMP-15，MMP-16)、膠原酶(MMP-1，MMP-8，MMP-13)、基質(zhì)溶解素(MMP-3，MMP-10)及其他類MMPs(MMP-12，MMP-19，MMP-20)[14]。膠原酶切除外源酶后，MMP-2，MMP-9在降解纖維性膠原過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，此外，MMP-2，MMP-9可降解層黏連蛋白、纖維黏連蛋白、彈性蛋白及各種膠原等[15]。本研究結(jié)果顯示，角膜炎組淚液中MMP-2、MMP-9水平顯著高于對照組。提示MMP-2、MMP-9的高表達(dá)可能與單皰病毒性角膜炎病情的發(fā)生密切相關(guān)。而研究表明，角膜炎中MMP-2、MMP-9的表達(dá)，可能是由于病毒大量復(fù)制、中性粒細(xì)胞浸潤，而浸潤的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等可產(chǎn)生MMPs[16]。李曉娜等[17]通過機(jī)械牽拉實(shí)驗(yàn)顯著增加炎性因子及MMP-9蛋白表達(dá)證明力學(xué)刺激可能通過釋放炎性因子，進(jìn)而上調(diào)MMP-9表達(dá)，促進(jìn)圓錐角膜的發(fā)生和發(fā)展。復(fù)發(fā)組淚液中MMP-2、MMP-9水平顯著高于未復(fù)發(fā)組。提示MMP-2、MMP-9水平可能除了參與單皰病毒性角膜炎原發(fā)性感染，有可能還參與其復(fù)發(fā)性感染，MMP-2、MMP-9表達(dá)水平的檢測有望成為疾病復(fù)發(fā)早期診斷的重要指標(biāo)。Pearson法分析結(jié)果顯示，單皰病毒性角膜炎患兒治療后復(fù)發(fā)患兒淚液中MMP-2、MMP-9水平呈正相關(guān)。提示MMP-2、MMP-9可能通過高表達(dá)，共同參與角膜再次感染單皰病毒，與病情復(fù)發(fā)關(guān)系密切。淚液MMP-2、MMP-9診斷單皰病毒性角膜炎治療后復(fù)發(fā)的AUC分別為0.788、0.873，特異性分別為88.0%、82.0%，敏感度分別為66.7%、83.3%。提示二者可能對于單皰病毒性角膜炎復(fù)發(fā)均有一定的診斷價值，且MMP-2診斷特異性更高，MMP-9診斷敏感度更高。二者診斷截?cái)嘀捣謩e為0.714 ng/ml、1.081 mg/l，提示MMP-2水平穩(wěn)定在0.714 ng/ml以下，MMP-9水平穩(wěn)定在1.081 mg/l以下時，治療后的單皰病毒性角膜炎患兒病情控制穩(wěn)定，無復(fù)發(fā)傾向。二者聯(lián)合診斷單皰病毒性角膜炎治療后復(fù)發(fā)的AUC為0.916(95%CI:0.835～0.997)，特異性為90.0%，敏感度為83.3%。提示二者聯(lián)合檢測可能對于診斷病情復(fù)發(fā)的價值更大，臨床中可通過密切監(jiān)測二者水平變化，指導(dǎo)治療和預(yù)后，降低復(fù)發(fā)率。

綜上所述，MMP-2、MMP-9在單皰病毒性角膜炎復(fù)發(fā)患兒淚液中呈高表達(dá)，其水平變化可能與病情復(fù)發(fā)密切相關(guān)，對于單皰病毒性角膜炎患兒復(fù)發(fā)的預(yù)防及臨床治療可提供指導(dǎo)意見。分析淚液MMP-2、MMP-9水平作為復(fù)發(fā)診斷指標(biāo)的優(yōu)勢主要有：淚液取材方便，對于患者配合度要求不高；該方法不受病灶形態(tài)影響，可定量檢測。但如何將淚液MMP-2、MMP-9水平檢測準(zhǔn)確、有效地應(yīng)用到臨床診斷單皰病毒性角膜炎復(fù)發(fā)中，仍需進(jìn)一步深入探究。