高粱酒糟高純度黃酮的制備及其抗氧化活性

蔣新龍 王 浩 蔣益花

(浙江樹(shù)人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，杭州 310015)

高粱 (Sorghumbicolor(L.)Moench) 屬禾本科高粱屬一年生草本植物，用途廣泛，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，既可食用、飼用，又可用于加工[1]。高粱中除含有豐富的單寧多酚成分外，還含有具有較好抗氧化活性的類(lèi)黃酮、酚酸、原花青素等多種酚類(lèi)化合物[2-4]。袁蕊等[5]用溶劑提取法提取高粱黃酮含量為0.54%；安靜等[6]分別采用溶劑提取法、超聲提取法和微波提取法等提取方法，測(cè)得高粱黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.38～2.77 mg/g；田新惠等[7]以6種釀酒高粱籽粒為研究對(duì)象，研究發(fā)現(xiàn)其總黃酮為123.06～434.84 mg/100 g，而且有良好的抗氧化活性。高粱是生產(chǎn)白酒的主要原料，高粱酒糟是釀酒工業(yè)的副產(chǎn)物，大多被用于加工飼料、肥料等方面，目前對(duì)于高粱酒糟深層次的開(kāi)發(fā)應(yīng)用很少。針對(duì)高粱酒糟資源化綜合利用及天然抗氧化劑市場(chǎng)的需求問(wèn)題，以高粱酒糟為原料，用微波協(xié)同雙水相提取黃酮；以所得黃酮粗提物為處理對(duì)象，采用多級(jí)雙水相體系純化得到高純度黃酮；以所得高純度黃酮為處理對(duì)象，對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究，為高粱酒糟綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高粱酒糟取自當(dāng)?shù)鼐茝S，采用幾何采樣法進(jìn)行樣品采集，將新鮮酒糟裝入密封袋后用保鮮盒帶回實(shí)驗(yàn)室，65 ℃烘箱烘干，粉碎過(guò)40目篩，備用。DPPH·、蘆丁、所用水為蒸餾水；其他試劑均為分析純。

UV-1600型紫外可見(jiàn)光譜儀，格蘭仕微波爐D8017TL-2H型，GZX-91400MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 總黃酮的測(cè)定

根據(jù)硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法測(cè)定黃酮含量[8]。用80%乙醇準(zhǔn)確配制0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液分別置于10 mL比色管中，各加80%乙醇至5 mL，加0.5 mL 5%NaNO2溶液，搖勻放置6 min，再加0.5 mL 10%A1(NO3)3溶液，搖勻，再放置6 min，加4 mL 4%NaOH溶液，搖勻放置15 min，同時(shí)做空白對(duì)照，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，得蘆丁質(zhì)量濃度C(mg/mL)與吸光度A之間的關(guān)系式為：A=25.289C+0.037 2，相關(guān)系數(shù)r=0.997 3。

精密吸取待測(cè)液1.0 mL于10 mL比色管中，按前述方法進(jìn)行操作，同時(shí)做空白對(duì)照，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。按回歸方程計(jì)算樣品液中黃酮得率Y。

式中：C為回歸方程的計(jì)算所得值/mg/mL；V為提取液總體積/mL；m為所用原料的質(zhì)量/g；n為稀釋倍數(shù)。

1.2.2 黃酮提取實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

雙水相體系的確定：徐方祥等[9]用微波輔助乙醇-磷酸氫二鉀雙水相法提取了菠蘿皮中的黃酮。根據(jù)池汝安等[10]采用濁點(diǎn)法所繪制的各雙水相體系相圖和南二龍[11]所建立的相比數(shù)據(jù)庫(kù)，本研究選取乙醇溶液作為有機(jī)相、磷酸氫二鉀作為分相鹽組成乙醇-磷酸氫二鉀雙水相提取高粱酒糟黃酮。

提取方法：精密稱(chēng)取一定質(zhì)量的原料置于提取容器中，加入一定體積無(wú)水乙醇、一定質(zhì)量的無(wú)機(jī)鹽、一定體積水組成的雙水相體系，在一定微波條件下提取一定時(shí)間，趁熱抽濾得濾液。靜置5 min，待其分層，收集上清液，得到黃酮提取液，測(cè)定黃酮得率。

單因素實(shí)驗(yàn)：按照1.2.2提取方法，在原料質(zhì)量1.000 0 g、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、磷酸氫二鉀用量10 g、微波時(shí)間50 s、微波功率中火、液料比50∶1的條件下，采用控制變量法進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。分別設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)梯度40%、50%、60%、70%、80%；磷酸氫二鉀用量梯度8.0、9.0、10.0、11.0、12.0 g；液料比梯度30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1；提取時(shí)間梯度為20、30、40、50、60 s；微波功率梯度為低火144 W、中低火288 W、中火464 W、中高火648 W、高火800 W，考量乙醇體積分?jǐn)?shù)、磷酸氫二鉀用量、液料比、提取時(shí)間和微波功率五因素對(duì)黃酮得率的影響。

響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)：因?yàn)槲⒉üβ首鳛殡x散型變量不宜使用響應(yīng)面方法，最佳微波功率作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的固定條件。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定一個(gè)雙水相體系影響因子(磷酸氫二鉀用量或乙醇濃度)，選取剩余3個(gè)因素為自變量，以黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.3 黃酮純化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

利用多級(jí)雙水相體系純化：用最佳提取工藝進(jìn)行雙水相提取，得上相1；將上相1在40 ℃用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至無(wú)乙醇，得到濃縮液1，冷凍干燥濃縮液1可得粗黃酮產(chǎn)品1；將濃縮液1加入一定量磷酸氫二鉀和無(wú)水乙醇重新得到最佳提取條件時(shí)的雙水相體系，以4 000 r/min離心20 min，得上相2，同樣用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮上相2得到濃縮液2，冷凍干燥濃縮液2可得純化黃酮產(chǎn)品Ⅱ。分別測(cè)定2次雙水相上、下相中黃酮含量，求出兩次雙水相體系的分配系數(shù)及兩個(gè)黃酮產(chǎn)品的純度。

1.2.4 黃酮抗氧化活性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將粗黃酮產(chǎn)品和純化黃酮產(chǎn)品加無(wú)水乙醇配制成黃酮含量為100 μg/mL的高濃度溶液，再用無(wú)水乙醇稀釋成梯度系列樣品溶液(2、5、8、10、20、40、60、80 μg/mL)。以VC做參比，以半數(shù)清除率IC50值為抗氧化活性評(píng)價(jià)指標(biāo)，比較高粱酒糟純化黃酮、高粱酒糟粗黃酮、VC抗氧化活性相對(duì)大小。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法及分析軟件

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)測(cè)定3次并取平均值，利用Origin8軟件作圖；響應(yīng)面優(yōu)化采用 Design-Expert 8.06 軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及回歸分析；應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)；用Duncan多重比較(SSR法)檢驗(yàn)各處理平均數(shù)之間的差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮提取實(shí)驗(yàn)

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的影響：由圖1可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%時(shí)黃酮的得率達(dá)到最高值。因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)80%與其他水平差異顯著，所以響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)時(shí)以乙醇體積分?jǐn)?shù)80%為固定值，通過(guò)優(yōu)化調(diào)節(jié)磷酸氫二鉀用量獲得高選擇性雙水相體系。

磷酸氫二鉀用量的影響：雙水相的形成是乙醇與磷酸氫二鉀爭(zhēng)奪水分子的過(guò)程。在乙醇-磷酸氫二鉀雙水相中，上相則由混有少量水的乙醇構(gòu)成，下相由溶解有磷酸氫二鉀的水及少量乙醇構(gòu)成。黃酮是醇溶性的，提取后進(jìn)入上相。磷酸氫二鉀的用量改變可影響到上相極性[14]，最終影響到黃酮的得率。圖1可知，磷酸氫二鉀用量為10.0 g/50 mL時(shí)，黃酮的得率達(dá)到最高值。

液料比對(duì)黃酮得率的影響：圖1可知，液料比高于50∶1時(shí)，黃酮的得率達(dá)到最高值。30～50∶1范圍內(nèi)，黃酮得率隨著液料比的增加而提高，當(dāng)高于50∶1時(shí)，液料比過(guò)大，傳熱速率下降，黃酮得率反而下降[15]。因此，初步選取最佳液料比為50∶1。

提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響：圖1可知，黃酮得率隨提取時(shí)間增加而提高，但超過(guò)50 s后黃酮得率基本穩(wěn)定，這主要由于50 s時(shí)黃酮基本提取完全，故初步選取最佳提取時(shí)間為50 s。

微波功率對(duì)黃酮得率的影響：微波功率過(guò)高，體系升溫過(guò)快，容易加速黃酮的氧化與降解。由圖1可知，隨著微波功率的增加，黃酮得率減少，在低火144W時(shí)達(dá)到最大值。故選取最佳微波功率為低火144 W。

圖1 單因素提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化黃酮提取結(jié)果及分析

根據(jù)1.2.2方法及單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以黃酮得率為響應(yīng)值，以乙醇濃度80%和微波功率低火144 W為固定值，對(duì)磷酸氫二鉀用量、液料比、提取時(shí)間3因子在3水平進(jìn)行響應(yīng)面分析優(yōu)選。表1為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 3因子在3水平微波提取響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)因素水平表

方差分析：采用Designexpert程序?qū)Ρ?所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，回歸實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。從表3中可以看出，液料比(A)的P值小于0.05大于0.01，說(shuō)明液料比對(duì)高粱酒糟黃酮的提取影響顯著，磷酸氫二鉀用量(B)的P值小于0.01，說(shuō)明磷酸氫二鉀用量對(duì)高粱酒糟黃酮的提取影響極顯著。方差分析說(shuō)明各個(gè)實(shí)驗(yàn)因子對(duì)高粱酒糟黃酮的提取影響由大到小的順序依次為：磷酸氫二鉀用量(B)、液料比(A)、提取時(shí)間(C)。方差分析也說(shuō)明各個(gè)具體實(shí)驗(yàn)因子與響應(yīng)值都不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系。

表2 3因子在3水平響應(yīng)面分析結(jié)果

表3 方差分析

擬合模型的建立：對(duì)響應(yīng)面測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，確立如下回歸方程：Y=+1.92-0.071A-0.100B+0.053C+0.078AB+0.048AC-0.076BC-0.170A2+8.500E-004B2-0.013C2。由表3可知，模型的P<0.05(顯著)，失擬項(xiàng)檢驗(yàn)的P=0.121 3(不顯著)，表明模型充分?jǐn)M合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，該方程是高粱酒糟黃酮的得率與提取工藝參數(shù)的合適數(shù)學(xué)模型。

交互作用分析：在液料比、磷酸氫二鉀用量、提取時(shí)間3個(gè)因素中任取兩個(gè)作為X和Y，以黃酮得率作為Z，作出相應(yīng)的三維曲面圖。相比而言，液料比(A)和磷酸氫二鉀用量(B)的交互作用較大，如圖2，表現(xiàn)為曲線(xiàn)比較陡，這與回歸分析的結(jié)果吻合。

圖2 三維曲面和回歸模型等值線(xiàn)

最優(yōu)工藝條件確定與模型驗(yàn)證：利用軟件繪出回歸模型的等值線(xiàn)(見(jiàn)圖2)，并確定模型的極大值點(diǎn)，預(yù)測(cè)所得最大黃酮含量為2.159%。利用軟件得出黃酮提取的最優(yōu)條件：在低火微波功率和乙醇濃度80%條件下，磷酸氫二鉀用量9 g/50 mL(即180 mg/mL)、提取時(shí)間60.00 s、液料比47.00 mL·g-1。根據(jù)實(shí)際最優(yōu)工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在此條件下測(cè)定黃酮得率，平行3次，得最大得率為2.16%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值無(wú)顯著差異，符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期，驗(yàn)證了模型的有效性。

李云龍等[16]采用乙醇回流提取法提取苦蕎酒糟黃酮，黃酮得率為1.642%；龍謀等[17]采用超聲輔助乙醇法提取苦蕎紅曲保健酒的酒糟黃酮，黃酮得率為1.828 %；王興東等[18]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，茅臺(tái)醬香型酒糟中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.040%。本研究測(cè)得高粱酒糟較其他酒糟黃酮含量高。

2.2 黃酮純化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一級(jí)雙水相體系提取后再進(jìn)行二級(jí)雙水相體系純化，高粱酒糟黃酮純度由47.12%增加到82.58%，分配系數(shù)由11.40增加到30.70。高粱酒糟黃酮的純度和分配系數(shù)分別提高1.8倍、2.7倍。利用多級(jí)雙水相體系純化制備高純度高粱酒糟黃酮切實(shí)可行。

2.3 黃酮抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定高粱酒糟粗黃酮、高粱酒糟純化黃酮對(duì)DPPH·的清除率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。根據(jù)圖3的量效關(guān)系，得到濃度和清除率的線(xiàn)性方程及清除率為50%時(shí)所需的濃度(IC50)，見(jiàn)表4。表4表明，VC、高粱酒糟粗黃酮、高粱酒糟純化黃酮在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)與清除DPPH·自由基呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系，其IC50分別為11.11 、56.47、47.98 μg/mL。高粱酒糟黃酮的抗氧化活性弱于VC(P<0.05)；純化黃酮的抗氧化活性明顯強(qiáng)于粗黃酮(P<0.05)，跟其他研究結(jié)果一致[19,20]。

表4 高粱酒糟黃酮清除DPPH·自由基的能力

圖3 黃酮清除DPPH·自由基的能力比較

3 結(jié)論

通過(guò)微波協(xié)同雙水相提取高粱酒糟黃酮，并用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得到最佳提取條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度180 mg/mL、液料比47∶1、微波功率低火、提取時(shí)間60 s，得率為2.16%；二級(jí)雙水相純化，純度可達(dá)82.58%。高粱酒糟黃酮的抗氧化活性弱于VC，二級(jí)雙水相純化有利增強(qiáng)抗氧化活性。微波協(xié)同雙水相法制備高粱酒糟黃酮得率和純度都較高，快速高效，安全便捷。