pH酸性偏移結(jié)合熱處理對(duì)米糠蛋白結(jié)構(gòu)的影響

吳曉娟 張佳妮 李 依 金曼芹 王曉嬋 沈佳麗 吳 偉

(中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；稻谷及副產(chǎn)物深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410004)

米糠是糙米碾米后的副產(chǎn)物，約占糙米總重的10%，富含蛋白質(zhì)、脂肪、膳食纖維及多種生理活性物質(zhì)[1]。米糠脫脂后蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)15%～20%，是一種豐富而價(jià)廉的植物蛋白資源。米糠蛋白因其過(guò)敏性低、氨基酸組成合理、生物效價(jià)高以及潛在的功能特性(乳化性、起泡性)，可作為配料應(yīng)用于飲料、醬料、肉制品、焙烤制品等多種食品[2]。鑒于米糠蛋白良好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及潛在的功能特性，目前越來(lái)越多研究聚焦于采用新的改性方法(如酸堿處理、酶處理、熱處理、超聲輔助等)，改變其結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，拓展其潛在應(yīng)用領(lǐng)域[3]。米糠蛋白的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和功能特性與其結(jié)構(gòu)特征密切相關(guān)，例如：米糠蛋白的消化特性與其氧化程度、亞基結(jié)構(gòu)和表面疏水性等因素密切相關(guān)[4]；功能特性與其表面電荷、極性氨基酸、表面疏水性、分子量大小等因素密切相關(guān)[5]。pH偏移是一種操作簡(jiǎn)單、成本低廉且效果顯著的改變蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的方法。pH偏移處理可以在一定程度上改變蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、亞基結(jié)構(gòu)、游離巰基、酪氨酸殘基等結(jié)構(gòu)特征[6]。近年來(lái)，部分研究還側(cè)重于將不同的蛋白質(zhì)改性方法相結(jié)合，如將pH偏移和熱處理相結(jié)合，可獲得更加精準(zhǔn)的蛋白質(zhì)分子柔性的調(diào)控方法[7]。pH酸性偏移結(jié)合熱處理可使大豆分離蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度的展開，疏水性氨基酸殘基暴露，但對(duì)于蠶豆蛋白則表現(xiàn)為使暴露于分子表面的疏水性氨基酸殘基重新包裹于疏水核心[8,9]。鑒于pH偏移結(jié)合熱處理對(duì)于不同蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征的影響差異較大，且目前也未見關(guān)于pH偏移結(jié)合熱處理影響米糠蛋白結(jié)構(gòu)特征的研究報(bào)道，本文擬研究pH酸性偏移(pH 1.5)結(jié)合溫和熱處理(50、60 ℃)對(duì)米糠蛋白結(jié)構(gòu)特征的影響，以期獲得一種簡(jiǎn)便有效的米糠蛋白結(jié)構(gòu)的調(diào)控方法，為合理開發(fā)米糠蛋白資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂米糠、蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)品(14～100 ku)、1-苯氨基萘-8-磺酸、5,5′-二硫代二硝基苯甲酸(5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB)(分析純)，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1800紫外可見分光光度計(jì)，IRTracer-100 傅里葉變換紅外光譜儀，LC-20液相色譜儀，Healthcare SE260電泳儀，F(xiàn)4600熒光分光光度計(jì)，Sorvall LYNX 6000高速落地離心機(jī)，F(xiàn)D5-4冷凍干燥機(jī)。

1.3 方法

1.3.1 制備米糠蛋白

參考吳偉等[10]方法，將100 g脫脂米糠與1 000 mL去離子水混合，用2 mol/L NaOH溶液將混合液調(diào)至pH 9.0，在40 ℃、120 r/min下水浴攪拌4 h，然后在4 ℃下離心20 min，轉(zhuǎn)速為8 000 r/min。取上清液用2 mol/L HCl溶液調(diào)至pH 4.0，靜置20 min，待出現(xiàn)明顯沉淀后在4 ℃、8 000 r/min下離心15 min。水洗沉淀并在4 ℃、8 000 r/min條件下離心15 min，重復(fù)2次。隨后用去離子水分散蛋白沉淀，并用2 mol/L HCl溶液調(diào)pH至7.0，最后冷凍干燥得到米糠蛋白。

1.3.2 米糠蛋白處理

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜分析

參考Liu等[11]的方法將米糠蛋白制成透明薄片，用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行掃描，波數(shù)范圍：400～4 000 cm-1，掃描次數(shù)：64，分辨率：4 cm-1。

1.3.4 游離巰基和總巰基含量測(cè)定

將米糠蛋白配制成濃度20 mg/mL的待測(cè)蛋白溶液，溶液中蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測(cè)定。參考Huang等[12]的方法，采用DTNB比色法測(cè)定米糠蛋白的游離巰基和總巰基含量。

1.3.5 分子量分布測(cè)定

將米糠蛋白配制成10 mg/mL的蛋白溶液，過(guò)孔徑0.45 μm的醋酸纖維素膜，對(duì)濾液采用LC-20A高效液相色譜儀進(jìn)行分析，色譜柱：TSKgel SW G4000 SWXL；檢測(cè)器：Waters 996光電二極管陣列檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：25 ℃；流動(dòng)相：0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2，含0.05 mol/L NaCl)；流速：1 mL/min。

1.3.6 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)12.5%的分離膠和4%的濃縮膠，含有0.05 mol/L Tris-0.384 mol/L甘氨酸、0.1%十二烷基硫酸鈉(pH 8.3)的電極緩沖液。在燒杯中分別加入10%十二烷基硫酸鈉，5 mL β-巰基乙醇，10 mL甘油，20 mg溴酚藍(lán)，20 mL 0.05 mol/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖液，最后加水至總體積100 mL，配制成樣品溶解液，再把米糠蛋白溶于樣品溶解液中配成1.5 mg/mL的電泳樣品。上樣量10 μL，起始電流10 mA，樣品進(jìn)入分離膠后電流調(diào)大到25 mA。

麥小秋陶醉地朝遠(yuǎn)處看著，不知什么時(shí)候他已經(jīng)環(huán)住了她的腰身，已經(jīng)在迷蒙中聽著她青草一樣的呼吸，暖色的燈光更襯托出一個(gè)女孩的輪廓，胸部在夜影中高聳，臉蛋像一只正在熟透的蘋果，逗人想掛上去的小嘴里含著兩排明亮的牙齒。饒哥低低地對(duì)小秋說(shuō)：“告訴你個(gè)好消息，我在競(jìng)爭(zhēng)一個(gè)重要職位，如果成功，也許能幫你更大的忙，解決更大的問題?！?/p>

1.3.7 內(nèi)源熒光光譜測(cè)定

將米糠蛋白用去離子水稀釋成0.1 mg/mL的蛋白溶液，采用F-4600型熒光光譜儀在激發(fā)波長(zhǎng)280 nm下掃描300～500 nm之間的發(fā)射光譜(狹縫寬度2.5，靈敏度為1)。

1.3.8 表面疏水性測(cè)定

將米糠蛋白用去離子水配制成20 mg/mL的蛋白溶液，再將其稀釋為0.005～0.50 mg/mL之間5個(gè)不同濃度梯度的蛋白溶液。在試管中分別加入不同濃度的蛋白溶液4 mL和8 mmol/L 1-苯氨基萘-8-磺酸溶液50 μL，在激發(fā)波長(zhǎng)390 nm、發(fā)射波長(zhǎng)470 nm下測(cè)定熒光強(qiáng)度。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)、熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，米糠蛋白表面疏水指數(shù)即曲線初始階段的斜率。

1.3.9 溶解度測(cè)定

參考Arte等[13]方法，將1.00 g米糠蛋白分散于100 mL 0.01 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液中，在室溫下磁力攪拌2 h，然后在10 000 r/min下離心20 min收集上清液，采用微量凱氏定氮法測(cè)定米糠蛋白樣品的總氮含量以及上清液的可溶性氮含量，通過(guò)可溶性氮含量與樣品總氮含量的百分比計(jì)算米糠蛋白的溶解度。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft excel 2010和Origin 7.5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果用“均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH酸性偏移結(jié)合熱處理對(duì)米糠蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

傅里葉變換紅外光譜是分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的主要技術(shù)之一，特別是酰胺Ⅰ帶(1 700～1 600 cm-1)是表征蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)最常用的特征頻率區(qū)域。參考Sun等[14]的方法對(duì)pH 1.5偏移結(jié)合熱處理的米糠蛋白去卷積酰胺I帶吸收光譜進(jìn)行Gaussian擬合，得到11個(gè)特征吸收峰，通過(guò)鑒定[14-16]：α-螺旋結(jié)構(gòu)，1 653 cm-1；β-折疊結(jié)構(gòu)，1 618、1 630、1 638、1 676、1 682、1 694 cm-1；β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，1 671 cm-1；無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，1 646、1 662 cm-1；氨基酸側(cè)鏈，1 609 cm-1。計(jì)算得到的米糠蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組成如表1所示，pH酸性偏移處理對(duì)米糠蛋白中較為穩(wěn)定的α-螺旋和β-折疊的相對(duì)含量影響較小，但會(huì)使部分無(wú)規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)展開,形成氨基酸側(cè)鏈。這可能是由于pH酸性偏移通常會(huì)使蛋白質(zhì)處于變性與未變性之間的熔球態(tài)，保持相對(duì)穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，因而對(duì)米糠蛋白中的有序結(jié)構(gòu)影響較小[9]；但在酸性環(huán)境下，蛋白質(zhì)分子羧基發(fā)生質(zhì)子化，分子間的靜電斥力便會(huì)增強(qiáng)，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子發(fā)生一定程度的展開，這可能是造成米糠蛋白中無(wú)序結(jié)構(gòu)展開形成氨基酸側(cè)鏈的主要原因[17]。pH 1.5偏移結(jié)合熱處理時(shí)，加熱1～3 h得到的米糠蛋白β-折疊相對(duì)含量明顯降低，無(wú)歸卷曲相對(duì)含量明顯增加，且溫度越高，去折疊程度越大；當(dāng)加熱時(shí)間延長(zhǎng)到5 h時(shí)，米糠蛋白發(fā)生復(fù)折疊反應(yīng)。周向軍等[9]在研究pH偏移結(jié)合熱處理對(duì)蠶豆蛋白結(jié)構(gòu)的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH 1.5偏移結(jié)合55 ℃熱處理1.5 h時(shí)，蠶豆蛋白的有序結(jié)構(gòu)開始向無(wú)序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，但未對(duì)加熱更長(zhǎng)時(shí)間的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行研究。付湘晉等[18]在用酸堿處理魚肌原纖維蛋白時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)分子會(huì)因熱變性而展開，隨后又會(huì)通過(guò)蛋白質(zhì)相互作用，包括疏水作用、氫鍵、—SH生成S—S鍵等產(chǎn)生聚集，這可能是pH 酸性偏移結(jié)合熱處理使得米糠蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)去折疊-復(fù)折疊趨勢(shì)的主要原因。

表1 pH酸性偏移結(jié)合熱處理對(duì)米糠蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

2.2 pH酸性偏移結(jié)合熱處理對(duì)米糠蛋白游離巰基和總巰基含量的影響

巰基是影響蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定性的主要側(cè)鏈基團(tuán)之一，對(duì)蛋白質(zhì)的功能特性也具有重要影響[19]。pH 酸性偏移以及結(jié)合熱處理的米糠蛋白巰基變化如表2所示，相比于未處理的米糠蛋白，pH酸性偏移以及結(jié)合熱處理的米糠蛋白總巰基和游離巰基含量均顯著下降。相比于單獨(dú)pH酸性偏移處理的米糠蛋白，結(jié)合熱處理的米糠蛋白游離巰基含量更低。耿蕊等[8]關(guān)于pH 偏移結(jié)合熱處理對(duì)大豆蛋白結(jié)構(gòu)影響的研究發(fā)現(xiàn)，游離巰基呈現(xiàn)類似的變化趨勢(shì)。蛋白質(zhì)巰基氧化是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，巰基通常先被自由基攻擊生成亞磺酰自由基，隨后再與分子氧形成硫醇自由基，然后繼續(xù)氧化形成二硫鍵，這一階段是可逆氧化反應(yīng)，而不可逆氧化反應(yīng)則進(jìn)一步生成亞磺酸、磺酸等[10]。加熱條件下蛋白質(zhì)游離巰基更易被自由基氧化，因而，熱處理加劇了米糠蛋白在酸性環(huán)境中的巰基氧化程度[20]。

表2 pH酸性偏移結(jié)合熱處理對(duì)米糠蛋白總巰基、游離巰基的影響

2.3 pH酸性偏移結(jié)合熱處理對(duì)米糠蛋白分子質(zhì)量分布的影響

圖1顯示了pH 酸性偏移以及結(jié)合熱處理對(duì)米糠蛋白分子質(zhì)量分布的影響。未處理的米糠蛋白主要有2個(gè)特征吸收峰，對(duì)應(yīng)保留時(shí)間分別為5.97 min和11.53 min，峰面積百分比分別為13.24%和86.76%，前者主要是蛋白質(zhì)聚集體等高分子物質(zhì)，后者主要是米糠蛋白及其亞基等小分子物質(zhì)[8]。采用pH 1.5偏移以及結(jié)合50 ℃和60 ℃處理均會(huì)促使米糠蛋白聚集體解離，當(dāng)處理時(shí)間為1 h時(shí)，保留時(shí)間5.97 min的峰面積百分比分別為0.92%、1.65%和1.83%。Jiang等[21]關(guān)于pH偏移處理大豆蛋白11S組分的研究也認(rèn)為，極端pH條件下，酸性亞基和堿性亞基組成的復(fù)合物容易被解離。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，單獨(dú)酸性偏移處理米糠蛋白的分子質(zhì)量分布變化不明顯，但結(jié)合熱處理的米糠蛋白聚集體含量會(huì)略微增加。當(dāng)處理時(shí)間5 h時(shí)，pH 1.5偏移結(jié)合50、60 ℃處理的米糠蛋白在保留時(shí)間5.97 min的峰面積百分比分別為2.74%、3.56%。由于米糠蛋白極易受內(nèi)源脂質(zhì)氧化酸敗產(chǎn)物氧化，而熱處理會(huì)加速蛋白質(zhì)氧化，這可能是導(dǎo)致聚集體增加的主要原因[10,20]。

圖1 pH酸性偏移結(jié)合熱處理對(duì)米糠蛋白分子質(zhì)量分布的影響

2.4pH酸性偏移結(jié)合熱處理對(duì)米糠蛋白亞基結(jié)構(gòu)的影響

pH1.5偏移以及結(jié)合熱處理米糠蛋白的亞基結(jié)構(gòu)變化如圖2所示，未處理的米糠蛋白亞基主要分布在40～60 ku, 37～39 ku和低于25 ku，其中37-39 ku是谷蛋白酸性亞基對(duì)應(yīng)的條帶[22]。當(dāng)對(duì)米糠蛋白單獨(dú)采用pH酸性偏移處理時(shí)，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，明顯看到37-38 ku條帶的顏色變深，這印證了前面分子質(zhì)量分布結(jié)果推測(cè)的蛋白質(zhì)聚集體中酸性亞基和堿性亞基復(fù)合物發(fā)生解離的現(xiàn)象。當(dāng)pH酸性偏移結(jié)合熱處理時(shí)，亞基結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的條帶又逐漸變淺，尤其是結(jié)合60 ℃熱處理時(shí)，谷蛋白酸性亞基和低分子質(zhì)量亞基逐漸消失。耿蕊等[23]在大豆分離蛋白的凝膠電泳圖中也觀察到，當(dāng)pH 1.5偏移結(jié)合60 ℃ 熱處理時(shí)，大豆蛋白亞基結(jié)構(gòu)(尤其是酸性亞基和堿性亞基)顯著減少。

2.5 pH酸性偏移結(jié)合熱處理對(duì)米糠蛋白內(nèi)源熒光光譜的影響

pH 1.5偏移結(jié)合熱處理的米糠蛋白內(nèi)源熒光光譜如圖3所示，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，米糠蛋白最大熒光峰位均出現(xiàn)先紅移再藍(lán)移的變化趨勢(shì)。未處理的米糠蛋白最大熒光峰位為346.0 nm，單獨(dú)pH 1.5、pH 1.5偏移結(jié)合50 ℃和60 ℃處理的米糠蛋白最大熒光峰位均在處理時(shí)間3 h時(shí)達(dá)到最大值，分別為349.0 nm，347.2 nm和347.4 nm。內(nèi)源熒光光譜中最大熒光峰位紅移表明蛋白質(zhì)中色氨酸殘基微環(huán)境極性增強(qiáng)[10]。結(jié)合傅里葉變換紅外光譜結(jié)果分析，pH 酸性偏移處理會(huì)誘導(dǎo)原先包裹在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水側(cè)鏈暴露到分子表面的極性環(huán)境中，使色氨基殘基微環(huán)境發(fā)生改變。隨著酸性偏移處理時(shí)間的延長(zhǎng)，米糠蛋白最大熒光峰位發(fā)生藍(lán)移，推斷可能是暴露出來(lái)的疏水基團(tuán)又因?yàn)槭杷嗷プ饔枚奂?，使米糠蛋白中色氨酸殘基微環(huán)境非極性增強(qiáng)。結(jié)果還顯示，熱處理會(huì)抑制米糠蛋白最大熒光峰位紅移，結(jié)合分子質(zhì)量分布和巰基變化結(jié)果推測(cè)，可能是熱處理誘導(dǎo)米糠蛋白氧化聚集造成的。

圖3 pH酸性偏移結(jié)合熱處理對(duì)米糠蛋白內(nèi)源熒光光譜的影響

2.6 pH酸性偏移結(jié)合熱處理對(duì)米糠蛋白表面疏水性的影響

疏水相互作用是維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力，pH偏移處理大豆蛋白的研究已證實(shí)，極端pH條件下蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)容易展開，致使表面疏水性顯著增加[6]。不同于大豆蛋白表面疏水性的持續(xù)增加，pH酸性偏移結(jié)合熱處理米糠蛋白的表面疏水性變化極其復(fù)雜(圖4)。這可能是由于相比大豆分離蛋白，米糠蛋白中殘留的內(nèi)源脂質(zhì)氧化酸敗產(chǎn)物更容易與其疏水側(cè)鏈反應(yīng)，導(dǎo)致表面疏水性下降[10]。因而，單獨(dú)采用pH酸性偏移處理的米糠蛋白表面疏水性呈現(xiàn)上升-下降-再上升的復(fù)雜變化。從圖4還可以看出，結(jié)合熱處理的米糠蛋白表面疏水性明顯大于單獨(dú)采用pH偏移處理的。Bax關(guān)于肌原纖維蛋白的研究也發(fā)現(xiàn)，熱處理會(huì)顯著增加蛋白質(zhì)的表面疏水性，并且熱處理導(dǎo)致的表面疏水性增加有利于蛋白質(zhì)無(wú)定形或纖維狀聚集體的形成[24]。

注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，余同。圖4 pH酸性偏移結(jié)合熱處理對(duì)米糠蛋白表面疏水性的影響

2.7 pH酸性偏移結(jié)合熱處理對(duì)米糠蛋白溶解性的影響

pH 1.5偏移結(jié)合熱處理的米糠蛋白溶解性如圖5所示，相比于未處理的米糠蛋白，單獨(dú)采用pH 1.5偏移處理的米糠蛋白溶解性顯著增加，這可能與酸性條件下米糠蛋白中天然聚集體的部分解離以及蛋白質(zhì)分子的適度展開相關(guān)。隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，僅僅采用酸性偏移處理的米糠蛋白溶解性未發(fā)生顯著變化，但酸性偏移結(jié)合熱處理的米糠蛋白溶解性逐漸下降，結(jié)合前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，這可能是加熱條件下蛋白質(zhì)分子通過(guò)疏水相互作用或氧化交聯(lián)形成聚集體所致。

圖5 pH酸性偏移結(jié)合熱處理對(duì)米糠蛋白溶解性的影響

3 結(jié)論

米糠蛋白經(jīng)pH酸性偏移結(jié)合熱處理后，其結(jié)構(gòu)特征發(fā)生了顯著變化。pH 1.5偏移處理對(duì)米糠蛋白中較為穩(wěn)定的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)影響較小，但會(huì)使部分無(wú)規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)展開，形成氨基酸側(cè)鏈，并伴隨巰基氧化；結(jié)合熱處理后，米糠蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)去折疊-復(fù)折疊的復(fù)雜變化，并且米糠蛋白巰基氧化程度增加。分子質(zhì)量分布、蛋白質(zhì)凝膠電泳和內(nèi)源熒光光譜的結(jié)果分析表明，單獨(dú)pH酸性偏移處理會(huì)促使米糠蛋白分子展開，導(dǎo)致酸-堿亞基復(fù)合物發(fā)生解離，但結(jié)合熱處理后，米糠蛋白又會(huì)通過(guò)疏水相互作用或氧化作用等形成聚集體。表面疏水性和溶解性的變化進(jìn)一步展現(xiàn)了米糠蛋白在pH酸性偏移結(jié)合熱處理過(guò)程中空間結(jié)構(gòu)的復(fù)雜變化，并印證了這一過(guò)程中米糠蛋白的展開-聚集行為。由此可見，通過(guò)更加深入地研究，pH酸性偏移結(jié)合熱處理有望成為一種很好地調(diào)控米糠蛋白結(jié)構(gòu)變化的方法。