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    榧樹基因組SSR分子標(biāo)記開發(fā)

    2020-11-05 09:22:20焦云鄔玉芬舒巧云
    浙江農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年11期
    關(guān)鍵詞:香榧條帶多態(tài)性

    焦云,鄔玉芬,舒巧云

    (寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)研究所,浙江 寧波 315040)

    榧樹(Torreyagrandis)通常為雌雄異株,鮮有雌雄同株,群體內(nèi)變異復(fù)雜,籽形各異。其中,浙江紹興、諸暨、嵊州等地的榧樹多樣性較為豐富,主要有細(xì)榧、珍珠榧、茄榧、象牙榧等[1-2]。

    簡(jiǎn)單序列重復(fù)(simple sequence repeat,SSR),又稱微衛(wèi)星序列,是廣泛存在于真核生物基因組中的遺傳標(biāo)記,具有檢測(cè)效率高、技術(shù)難度低、實(shí)驗(yàn)成本低等優(yōu)點(diǎn),目前已廣泛應(yīng)用于中國(guó)李[3]、核桃[4]、棗[5]等林木遺傳多樣性分析和指紋圖譜的繪制。本研究基于榧樹基因組DNA序列篩選出SSR位點(diǎn)分析并設(shè)計(jì)引物,然后合成部分引物并從中篩選出擴(kuò)增條帶清晰,且多態(tài)性高的引物組合,為榧樹遺傳多樣性分析、品種指紋圖譜構(gòu)建和分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    基因組數(shù)據(jù)為課題組前期從頭測(cè)序所得,測(cè)序樣品為采集于浙江寧海的香榧葉片,測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。于2020年4月5日采集香榧植株嫩葉,使用Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒(上海,生工生物工程股份有限公司)提取基因組DNA存于-80 ℃冰箱備用。于浙江嵊州采集2020-19、2020-29、2020-32、2020-34、珍珠榧、細(xì)榧和茄榧樣品,其中2020-19為雌雄同株,其余均為雄株。于浙江寧波采集2020-44、2020-68和2020-69樣品,均為雄株。

    1.2 方法

    將香榧基因組從頭測(cè)序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控,過濾質(zhì)量值低于30的堿基,利用CLC Genomics Workbench 12.0(QIAGEN,https://www.qiagen.com)軟件拼接組裝基因組DNA序列,然后使用MISA和Primer 3.0(https://webblast.ipk-gatersleben.de/misa/)腳本對(duì)上述序列中SSR位點(diǎn)進(jìn)行篩選并設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物;選擇其中擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度在100~300 bp,GC含量在40%~60%,退火溫度58~62 ℃的引物20對(duì),并在其5′端添加熒光基團(tuán)和M13通用引物序列(TGTAAAACGACGGCCAGT),委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    基于基因組DNA,使用Taq PCR Master Mix試劑盒(上海,生工生物工程股份有限公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增;擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后取適量在ABI3730遺傳分析儀上進(jìn)行基因型分型檢測(cè),檢測(cè)后的原始數(shù)據(jù)使用Peak Scanner Software v1.0(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)軟件進(jìn)行讀數(shù),只統(tǒng)計(jì)長(zhǎng)度范圍為100~500 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物片段,然后使用Excel 2010構(gòu)建數(shù)據(jù)矩陣表;利用軟件POPGENE 1.32計(jì)算所有引物組合的Shannon信息指數(shù)和有效等位基因數(shù);基于遺傳相似矩陣[6],使用非加權(quán)組平均法(UPGMA)及軟件Free Tree 0.9.1.50進(jìn)行聚類分析,其中bootstrap值設(shè)置為1 000,聚類圖的修改使用軟件Tree view 1.6.6。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 SSR引物多態(tài)性

    使用10個(gè)榧樹品種樣品所提取的基因組DNA對(duì)SSR引物進(jìn)行多態(tài)性評(píng)價(jià),共擴(kuò)增出35個(gè)條帶,平均每個(gè)引物可擴(kuò)增6個(gè)條帶(表1)。此外,平均有效等位基因位點(diǎn)數(shù)量和Shannon信息指數(shù)分別為4.784 8和1.779 2。每個(gè)引物組合擴(kuò)增條帶數(shù)量范圍為4~9;其中,XF2096可擴(kuò)增出條帶數(shù)量最多,為9個(gè),其有效等位基因位點(diǎn)數(shù)量和Shannon信息指數(shù)分別為7.142 9和2.068 5。

    表1 香榧SSR引物組合多態(tài)性信息

    2.2 基于SSR分子標(biāo)記的香榧遺傳多樣性

    基于6對(duì)SSR引物的分型結(jié)果并采用UPGMA法構(gòu)建10個(gè)榧樹品種的遺傳親緣關(guān)系聚類樹(圖1)。當(dāng)遺傳相似系數(shù)約為0.73時(shí),可將所有試材分為3個(gè)組。A組包含有4個(gè)榧樹品種,其中包括細(xì)榧和茄榧。B組和C組分別包含有3個(gè)榧樹品種,其中,B組包括著名榧樹類型珍珠榧和兩個(gè)榧樹雄株,意味著它們相近的遺傳背景;而C組均為榧樹雄株。

    聚類樹分支置信度計(jì)算中bootstrap值設(shè)置為1 000,聚類樹上僅顯示50以上的分支置信度數(shù)值。圖1 基于SSR分子標(biāo)記分型產(chǎn)生的10份榧樹試材聚類樹

    3 小結(jié)與討論

    榧樹為我國(guó)特有的珍稀樹種之一,其分布范圍廣,遺傳來(lái)源地理環(huán)境復(fù)雜,種內(nèi)與種間性狀變異十分復(fù)雜,有許多自然變異類型[2]。其中,香榧是集果用、油用、藥用等為一體的多用途經(jīng)濟(jì)樹種,屬于名貴干果。因此,開發(fā)相應(yīng)的分子標(biāo)記用于探討其遺傳多樣性,種質(zhì)資源保存及優(yōu)異種質(zhì)篩選是當(dāng)前的研究重點(diǎn)之一。值得注意的是,前期研究報(bào)道中榧樹相關(guān)的分子標(biāo)記主要以AFLP[7]、RAPD[8]、ISSR[9]等為主,其操作過程較為繁瑣、成本較高,相對(duì)于上述分子標(biāo)記類型,SSR分子標(biāo)記具有成本低、操作簡(jiǎn)便和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn),可作為榧樹群體結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià)和遺傳多樣性分析的首選分子標(biāo)記類型。

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