ω-3不飽和脂肪酸功能性納米載體的設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥作用研究

王春雷 魏曉炎 邵國(guó)良

近年來，惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率不斷上升，已經(jīng)成為全球人類的一個(gè)主要死亡原因。肝癌位居惡性腫瘤死亡原因第3位，雖然手術(shù)切除治療能夠緩解癌癥的發(fā)展，但患者術(shù)后5年生存率仍較低[1]。而化療因受腫瘤普遍存在的多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）和藥物嚴(yán)重不良反應(yīng)等原因限制，仍缺乏理想的效果。MDR是指惡性腫瘤細(xì)胞對(duì)一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥的同時(shí)，對(duì)其他從未接觸過的、結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制完全不同的抗腫瘤藥物也產(chǎn)生抗藥性[2]。目前仍欠缺能有效克服腫瘤MDR的策略，如何逆轉(zhuǎn)MDR已經(jīng)成為抗腫瘤研究領(lǐng)域亟待解決的問題之一。

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）是一種必需的ω-3不飽和脂肪酸，是細(xì)胞膜的關(guān)鍵成分，在脊椎動(dòng)物大腦功能中起著重要作用[3]。以DHA為代表的ω-3不飽和脂肪酸對(duì)惡性腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸有明顯影響，研究表明ω-3不飽和脂肪酸在逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR方面具有突出的潛在應(yīng)用價(jià)值。Gelsomino等[4]發(fā)現(xiàn)ω-3脂肪酸能通過下調(diào)膽固醇的合成和改變抗去污劑膜成分從而對(duì)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞具有化學(xué)敏感性。但ω-3不飽和脂肪酸對(duì)肝癌MDR的影響尚鮮見報(bào)道，影響機(jī)制也不明確，如何利用ω-3不飽和脂肪酸逆轉(zhuǎn)肝癌MDR有待進(jìn)一步研究。因此本研究設(shè)計(jì)DHA為代表的ω-3不飽和脂肪酸功能性納米載體，探究其協(xié)同阿霉素（doxorubicin，DOX）給藥對(duì)肝癌MDR的影響及其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑與儀器 人肝癌細(xì)胞HepG2和人肝癌耐藥細(xì)胞HepG2/ADM均購自上海雅吉生物科技有限公司；DHA和DOX均購自美國(guó)Sigma公司；葉酸聚乙二醇磷脂（DSPE-PEG2000-Folate）購自西安瑞禧生物科技有限公司；RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)公司；大豆磷脂、BCA蛋白定量試劑盒、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑、預(yù)染蛋白marker均購自美國(guó)Solarbio公司；MDR相關(guān)蛋白（MRP）抗體購自美國(guó)Affinity Biosciences公司；肺耐藥相關(guān)蛋白（LRP）、乳腺癌抗藥性蛋白（BCRP）、凋亡相關(guān)蛋白（Bcl-2）抗體均購自上海Abcam公司；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)液（DMEM）、胰蛋白酶溶液（0.25%）均購自美國(guó)Hyclone公司；FBS購自浙江天杭生物科技。Micro17R型低溫高速離心、BB150型細(xì)胞培養(yǎng)箱機(jī)均購自美國(guó)Thermo公司；Zeta PALS型粒度分析儀購自美國(guó)BIC公司；EPS300型電泳儀、VE180C型電泳槽和VE1816型轉(zhuǎn)膜儀購自上海天能公司；610020-9Q型化學(xué)發(fā)光儀購自上海勤翔公司；AE2000型倒置顯微鏡購自中國(guó)Motic公司；Axio Observer A1型倒置熒光顯微鏡購自德國(guó)ZEISS公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HepG2、HepG2/ADM細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d傳代1次，實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.2.2 載藥納米載體的構(gòu)建及表征 采用高壓乳化的方法制備載藥納米載體，選取DHA、DOX為油相，大豆磷脂和DSPE-PEG2000-Folate為表面活性劑，甘油為助表面活性劑。將處方量的DHA、DOX和表面活性劑混合，加熱融解，2 000 r/min高速剪切，將油相滴入含助表面活性劑的水相中，剪切混勻，高壓乳勻機(jī)，800 bar的壓力，乳化8遍，即得，充氮密封保存。取所制的載藥納米載體溶于去離子水中，設(shè)置溶劑為水，用粒度分析儀測(cè)定平均粒徑為120 nm。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 將兩種細(xì)胞分為HepG2/ADM組、HepG2+DOX組、HepG2+DOX納米粒組、HepG2/ADM+DOX組、HepG2/ADM+DOX納米粒組。HepG2+DOX組、HepG2/ADM+DOX組細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)加入5 μg/ml DOX溶液，HepG2+DOX納米粒組和HepG2/ADM+DOX納米粒組細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)加入5 μg/ml DOX納米載體（下述）。

1.2.4 細(xì)胞活性檢測(cè) 采用CCK-8法。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞以 1×105/ml，和 HepG2/ADM細(xì)胞以5×104/ml分別接種于 96孔培養(yǎng)板，100 μl/孔。在 37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，分別加入相應(yīng)藥物，對(duì)照孔加相應(yīng)體積的培養(yǎng)液，每組設(shè)5個(gè)平行孔，培養(yǎng)48 h后，每孔加10 μl CCK-8溶液，再培養(yǎng)4 h，用酶聯(lián)免疫儀在波長(zhǎng)450 nm處讀取吸光度（A）值，取平均值。按公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=[（實(shí)驗(yàn)組（OD）-空白組（OD）]/（對(duì)照組（OD）-空白組（OD）]×100%。

1.2.5 載藥納米粒細(xì)胞攝取能力檢測(cè) 將HepG2和HepG2/ADM細(xì)胞以1×105/孔接種于共聚焦專用的四室小皿中，培養(yǎng)4～8 h后，分別加入5 μg/ml DOX溶液或5 μg/ml DOX 納米載體，37 ℃共孵育 2、8、24 h。棄去培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次，每孔用0.5 ml的4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3次，在倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)載藥納米粒的分布情況。

1.2.6 載藥納米粒的細(xì)胞內(nèi)DOX濃度測(cè)定 將HepG2和HepG2/ADM細(xì)胞接種于6個(gè)12孔板，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)1個(gè)12孔板，每組設(shè)置3個(gè)平行孔；分別給予5 μg/ml DOX 溶液或 5 μg/ml DOX 納米載體，孵育 1、2、4、8、12、24 h后棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入100 μl RIPA細(xì)胞裂解液，再加入900 μl PBS，反復(fù)凍融，離心后取上清液，采用分光光度法測(cè)定熒光值，計(jì)算DOX濃度。

1.2.7 MRP、LRP、BCRP、Bcl-2蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2和HepG2/ADM細(xì)胞制成1×108/ml單細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，5組細(xì)胞貼壁后分別加入相應(yīng)藥物作用48 h后收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，用BCA法測(cè)蛋白濃度。分別取適量蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%脫脂奶粉搖床振蕩1.5～2 h，將膜放入含一抗稀釋液的孵育盒中，4℃搖床振蕩孵育過夜；TBST洗10 min×3次，加入用5%脫脂奶粉封閉液稀釋的二抗，室溫?fù)u床振蕩反應(yīng)1～2 h，TBST洗膜5 min×3次。在PVDF膜上滴加A、B兩種ECL發(fā)光試劑的混合液，充分接觸反應(yīng)3 min。掃描條帶，采用chemi caPture軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行拍攝。每組分別進(jìn)行3次獨(dú)立的平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5組細(xì)胞存活率比較 與HepG2/ADM組比較，HepG2+DOX組、HepG2+DOX納米粒組、HepG2/ADM+DOX組、HepG2/ADM+DOX納米粒組存活率均明顯為低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；與HepG2/ADM+DOX組比較，HepG2/ADM+DOX納米粒組存活率為低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 5組細(xì)胞存活率比較（%）

2.2 HepG2和HepG2/ADM細(xì)胞的藥物攝取能力 隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞熒光強(qiáng)度增加，藥物攝取能力增強(qiáng)。HepG2/ADM+DOX納米粒組藥物攝取能力最強(qiáng)，HepG2+DOX納米粒組次之，HepG2+DOX組最弱，見圖 1（插頁）。

圖1 HepG2和HepG2/ADM細(xì)胞的藥物攝取能力（DOX為阿霉素；×200）

2.3 載藥納米粒的細(xì)胞內(nèi)DOX濃度比較 隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，HepG2與HepG2/ADM細(xì)胞內(nèi)DOX濃度均持續(xù)增長(zhǎng)。HepG2+DOX納米粒組與HepG2+DOX組、HepG2/ADM+DOX納米粒組與HepG2/ADM+DOX組相比，細(xì)胞內(nèi)DOX濃度高且增長(zhǎng)速率較快，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見圖2。

圖2 細(xì)胞內(nèi)DOX濃度變化曲線（DOX為阿霉素）

2.4 5 組細(xì)胞 MRP、LRP、BCRP、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平比較 與HepG2/ADM組相比，HepG2+DOX組、HepG2+DOX納米粒組和HepG2/ADM+DOX納米粒組細(xì)胞中MRP、LRP、BCRP與Bcl-2蛋白表達(dá)水平均明顯為低（均 P＜0.05），見圖 3、表 2。

3 討論

圖3 5組MRP、LRP、BCRP與Bcl-2蛋白電泳圖（MRP為多藥耐藥相關(guān)蛋白；LRP為肺耐藥相關(guān)蛋白；BCRP為乳腺癌抗藥性蛋白；Bcl-2為凋亡相關(guān)蛋白；A：HepG2/ADM 組；B：HepG2+DOX 組；C：HepG2+DOX 納米粒組；D：HepG2/ADM+DOX 組；E：HepG2/ADM+DOX納米粒組；DOC為阿霉素）

DHA是人類大腦和視網(wǎng)膜組織中細(xì)胞膜的組成成分，也是胎兒出生后早期大腦和視力發(fā)展的重要組成部分[5]，近年來人們發(fā)現(xiàn)以DHA為代表的ω-3不飽和脂肪酸對(duì)惡性腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸具有突出的影響。Mahmoudi等[6]發(fā)現(xiàn)DHA可降低多能性網(wǎng)絡(luò)基因的高表達(dá)水平，并重新激活DNA錯(cuò)配修復(fù)缺失/鼠類肉瘤病毒癌基因突變的結(jié)直腸癌干細(xì)胞樣細(xì)胞中的半胱氨酸蛋白酶-3和凋亡，表明了DHA在CRC治療中的應(yīng)用潛力，其在協(xié)同藥物增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥功效方面具有一定作用。

腫瘤細(xì)胞的MDR是臨床用藥和新藥開發(fā)的主要障礙。尋找具有強(qiáng)抗MDR性的新化合物是克服腫瘤耐藥的有效途徑[7]。MDR的主要機(jī)制之一是膜三磷酸腺苷結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過表達(dá)，例如P-糖蛋白（Pgp/ABCB1）、MDR 相關(guān)蛋白（MRP/ABCC）和乳腺癌抵抗蛋白（BCRP/ABCG2）[4，8-10]。其他與 MDR 有關(guān)的因素還有肺耐藥相關(guān)蛋白的高表達(dá)[11]、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽的升高[12]、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ相關(guān)的DNA損傷修復(fù)增加、抑制藥物誘導(dǎo)的p53凋亡以及與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）相關(guān)的癌細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控[13]?；谏鲜鲅芯浚狙芯客ㄟ^檢測(cè)MRP、LRP、BCRP、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平來反映功能性納米載體藥物對(duì)肝癌細(xì)胞MDR的逆轉(zhuǎn)效果。Western blot結(jié)果表明，HepG2/ADM+DOX納米粒組細(xì)胞中ADM相關(guān)蛋白表達(dá)量總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且MRP與LRP蛋白的表達(dá)水平均顯著下降，這提示DOX納米?？梢韵抡{(diào)細(xì)胞ADM相關(guān)蛋白表達(dá)水平，以高效克服腫瘤MDR，進(jìn)而使DOX可以充分揮發(fā)其抗腫瘤作用，增加MDR細(xì)胞的程序性死亡，提高抗腫瘤藥物的體內(nèi)療效。

表2 5組細(xì)胞MRP、LRP、BCRP、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較

MDR機(jī)制的復(fù)雜性決定了在逆轉(zhuǎn)MDR中應(yīng)有協(xié)同用藥的理念。如Dong等[14]開發(fā)了核殼納米粒來同時(shí)包封紫杉醇和吉西他濱用于乳腺癌治療，與單獨(dú)的紫杉醇或相同濃度的單獨(dú)吉西他濱治療相比，兩藥的共同遞送系統(tǒng)呈現(xiàn)顯著的抗癌效果，同時(shí)體內(nèi)全身性毒性降低。Devalapally等[15]設(shè)計(jì)了一種共載外源性神經(jīng)酰胺和紫杉醇的聚環(huán)氧乙烷-聚ε-己內(nèi)酯聚合物膠束，用于治療耐紫杉醇的卵巢癌細(xì)胞株（SKOV-3TR），發(fā)現(xiàn)相比于單獨(dú)使用紫杉醇，聯(lián)合用藥療效增加100倍。本研究采用DOX和MDR逆轉(zhuǎn)劑共輸送以增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)肝癌MDR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥使MDR細(xì)胞對(duì)DOX的敏感性增加至非耐藥細(xì)胞的敏感性水平，藥物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用也更加顯著。雖然化療藥和MDR逆轉(zhuǎn)劑的共輸送能夠在一定程度上增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)MDR的作用，一般逆轉(zhuǎn)劑在應(yīng)用時(shí)存在極大不良反應(yīng)，損害患者生活質(zhì)量，限制了其臨床應(yīng)用[16]。與一般逆轉(zhuǎn)劑不同，本研究設(shè)計(jì)的DHA納米載體是高安全性的功能性輔料，對(duì)開發(fā)高效低毒的功能性納米給藥系統(tǒng)具有重要意義。此外，納米技術(shù)可以通過改善化療藥物給藥途徑、拮抗和抵消腫瘤細(xì)胞主動(dòng)外排藥物的作用從而提高了腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，是DOX納米粒載體另一大優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，基于ω-3不飽和脂肪酸的功能性納米載體的DOX可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)肝癌MDR，其內(nèi)在機(jī)制可能是通過下調(diào)與ADM發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的MRP與LRP蛋白的表達(dá)。該結(jié)果為進(jìn)一步利用基于ω-3不飽和脂肪酸的功能性納米載體來逆轉(zhuǎn)肝癌MDR提供了理論依據(jù)，為開發(fā)了有效給藥系統(tǒng)提供新的思路。