白及花花青素微波提取方法的優(yōu)化

王 禎，王 潔，項海萍，樊澤鵬，孫誠蔓，邢丙聰，邵清松

（1. 浙江農(nóng)林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300；2. 浙江農(nóng)林大學 林業(yè)與生物技術學院，浙江 杭州 311300）

白及Bletilla striata為蘭科Orchidaceae白及屬Bletilla多年生草本植物，主產(chǎn)于安徽、浙江、江西、貴州等地[1]，以干燥塊莖入藥，又名甘根、白給、白芨等[2]。具有收斂止血，消腫生肌的功效，對于咯血、吐血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂等有效[3]。因白及以其干燥塊莖入藥，故國內外對白及花的研究較少。白及花期為每年4?5月，花序具花3～10朵，花色為紫紅色、粉紅色[4]，具有較高的觀賞價值，還富含多種花青素等活性成分，其水提物具有較好的抗氧化能力，可作為飲品進行開發(fā)利用[5]?；ㄇ嗨?anthocyanidins)為水溶性天然色素，屬于多酚化合物中的類黃酮化合物，是由花色苷水解得到的有顏色的苷元[6?7]，但在自然界中很少以游離的苷元而多以糖苷的形式存在[8]。花青素不僅是植物中的主要呈色物質，還具有抗氧化[9]、降血脂[10]、抗癌[11]、抑制神經(jīng)炎癥、改善血管功能[12]、平衡腸道微生物群落[13]、減緩與肝功能及結構有關的衰老惡化[14]與改善輕度至中度癡呆老年人的特定認知結果[15]等功效。花青素穩(wěn)定性差，在提取純化過程中易發(fā)生降解[16]。微波法對天然色素的提取具有色素產(chǎn)率高、色價高、節(jié)省溶劑、節(jié)省時間等優(yōu)點[17]。pH示差法和高效液相色譜法(HPLC)是定量測定花青素的常用方法，兩者具有很高的相關性[18]，其中pH示差法被農(nóng)業(yè)化學家協(xié)會(AOAC)正式作為研究實驗室和食品工業(yè)中各種水果和蔬菜總花青素的基本測量方法[19?20]。本研究采用微波法進行響應面優(yōu)化白及花花青素提取，并采用pH示差法測定白及總花青素，以期為白及花中花青素的綜合開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

白及花采于浙江省湖州市安吉縣上墅鄉(xiāng)白及基地。采摘盛花期的白及花，去除花莖部分后，于烘箱50 ℃烘干至恒量(±0.005 g)，打粉后過24目篩。于?20 ℃避光儲存，備用。氯化鉀(西隴化工股份有限公司)、無水乙酸鈉(西隴化工股份有限公司)、鹽酸(上海凌峰化學試劑有限公司)、無水甲醇(浙江漢諾化工科技有限公司)均為分析純。pH計FE20[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]，AK-1000A 500克搖擺式中藥粉碎機(溫嶺市奧力中藥機械有限公司)，DHG-9031A電熱恒溫干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)，F(xiàn)A2204電子分析天平(上海力辰儀器科技有限公司)，NJL07-3型實驗微波爐(南京杰全微波設備有限公司)，RE-2000A旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，TDL-50C低速離心機(上海安亭科學儀器廠)，Epoch2酶標儀(美國BioTek儀器有限公司)。

2 方法

2.1 總花青素的提取

取白及花粉末加入甲醇溶液(以體積分數(shù)為1%鹽酸作溶劑)進行微波萃取，離心取上清液，殘渣進行再次提取，合并2次上清液于35 ℃旋蒸1 h后用提取劑定容至10 mL，?20 ℃避光保存直至測定。

2.2 pH 示差法測定花青素條件優(yōu)化

2.2.1 吸收波長的確定 因深色花色苷在可見光區(qū)的吸收波長范圍為 465～560 nm[7]，所以取花青素提取液0.2與0.6 mL的pH 1.0緩沖液混勻，于450～600 nm波長范圍內以步長5 nm進行掃描，以確定最大吸收波長。

2.2.2 平衡時間的確定 分別取花青素提取液 0.2 與 0.6 mL 的 pH 1.0 緩沖液或 pH 4.5 緩沖液混勻，室溫下避光反應0～120 min，每隔10 min測定D(530)、D(700)，以確定最佳平衡時間。

2.3 提取次數(shù)的確定

精確稱取樣品，在料液比為1∶40(料單位為g，溶液單位為mL)、體積分數(shù)為80%的甲醇溶液(以體積分數(shù)為 1% 鹽酸稀釋)、微波功率 400 W 的條件下提取 10 min，冷卻至室溫后 4 000 r·min?1離心 15 min，取上清液于35 ℃旋蒸，用提取劑定容至10 mL，為第1次提取液。將殘渣重復上述操作，為第2次提取液。共進行4次提取，按2.4分別進行總花青素質量濃度測定，以確定最佳提取次數(shù)。

2.4 總花青素質量濃度測定

參考李文峰等[21]總花青素質量濃度測定方法并略作調整。取0.2 mL花青素提取液，分別與0.6 mL的pH 1.0氯化鉀緩沖液、pH 4.5醋酸鈉緩沖液混勻。室溫下避光靜置80 min后測定D(530)、D(700)。3次重復，取平均值?？偦ㄇ嗨?TAC)質量分數(shù)以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)的含量為標準進行計算，計算公式[22]為：TAC= {[D(530)pH1.0?D(700)pH1.0]?[D(530)pH4.5?D(700)pH4.5]}MWDF/(εL)。其中，TAC青素質量濃度(g·L?1)，D為各pH值下不同波長對應的吸光度，MW為C3G的分子量(449.2)，DF為稀釋倍數(shù)，ε為C3G的克分子吸光率常數(shù)(26 900)，L為比色皿光程(1 cm時，L=1)。再將總花青素質量濃度換算成質量分數(shù)進行對比分析。

2.5 單因素實驗

以微波功率、甲醇體積分數(shù)、提取時間和料液比為單因素，分別進行參數(shù)范圍的確定，考察不同因素對總花青素提取量的影響。精確稱取樣品，在甲醇體積分數(shù)為80%、料液比(溶質單位為g，溶劑單位 mL)1∶40、提取 20 min 的條件下，進行微波功率 (160、240、320、400、480、560、640 W，誤差為±5 W)的范圍確定；在微波功率560 W、料液比1∶40、提取20 min的條件下，確定甲醇體積分數(shù)(20%、40%、60%、80%、100%)的區(qū)間范圍；在微波功率560 W、甲醇體積分數(shù)80%、料液比1∶40的條件下，考察微波時間(2、5、10、20、30 min)的影響；在微波功率560 W、提取20 min、體積分數(shù)為80% 甲醇的條件下，進行料液比 (1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)的范圍確定。按 2.4 分別進行總花青素提取量的計算。

2.6 響應面實驗

為獲得白及花中花青素的最佳提取工藝條件，在單因素結果的基礎上，以總花青素提取量為響應值，選取微波功率(A)、甲醇體積分數(shù)(B)、微波時間(C)和料液比(D)為自變量，應用Design-Expert.V8.0.6.1軟件，按照Box-Behnken中心組合設計原理，設計4因素3水平的響應面實驗。設計因素與水平如表1所示。

表 1 響應面實驗因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used in Box-Behnken design

3 結果與分析

3.1 pH 示差法測定花青素條件優(yōu)化

由圖1所示：溶液吸光度在450～530 nm區(qū)間逐漸升高，在530 nm處達最大值(0.37)，當波長繼續(xù)增加溶液吸光度逐漸下降。因此白及花中花青素在可見光譜范圍內的最大吸收波長為530 nm。

圖 1 白及花中花青素的可見光圖譜Figure 1 Visible light spectrum of anthocyanins of B. striata flowers

圖 2 白及花中花青素在緩沖液中隨時間的吸光度變化Figure 2 Change in absorbance of anthocyanins in B. striata flower over time in buffer solution

由圖2所示：D(530)隨著時間的延長而降低，50 min后吸光度變化平穩(wěn)，并在80～100 min范圍內最為平穩(wěn)；在pH 4.5緩沖液中，隨著時間的增加，D(530)逐漸降低，在80～90 min時，吸光度相對處于穩(wěn)定狀態(tài)。因此，80 min為花青素在緩沖液中的平衡時間。

3.2 花青素的提取次數(shù)

由圖3所示：白及花中花青素隨提取次數(shù)增加而降低。第1次提取所得總花青素的提取量最大，第2次提取的提取量約為第1次的16.90%，第3、4次提取的提取量約為第1次的0.70%、0.17%。因此，為盡可能對樣品提取完全，且提高提取效率不造成溶劑浪費，選擇對樣品進行2次提取。

圖 3 白及花中花青素不同提取次數(shù)的提取量差異Figure 3 Difference in extraction amount of different extraction times of B. striata flower anthocyanin solution

3.3 單因素實驗結果

3.3.1 微波功率對總花青素提取量的影響 由圖 4所示：當微波功率為160～560 W時，總花青素的提取量隨著微波功率的增大而提高；微波功率為560 W時出現(xiàn)頂點，而后隨著功率增大出現(xiàn)了下降趨勢。這是因為在一定范圍內，隨著微波功率的增大對細胞的破壞力也逐步增強，花青素溶出物增多；但功率過高使得溫度升高，對花青素造成了一定程度的破壞，使得提取量降低。因此依據(jù)結果選擇微波功率480、560和640 W進行響應面實驗。

3.3.2 甲醇體積分數(shù)對總花青素提取量的影響 由圖5所示：當甲醇體積分數(shù)為20%～60%時，總花青素的提取量沒有明顯變化；當甲醇體積分數(shù)為60%～80%時，提取量隨著甲醇體積分數(shù)的增加而提高，在80%處達到最大值，隨后逐漸下降。說明在一定范圍內，提高甲醇體積分數(shù)有利于花青素的提取。因此依據(jù)實驗結果選擇甲醇體積分數(shù)為70%、80%和90%進行響應面實驗。

圖 4 微波功率對總花青素提取量的影響Figure 4 Effect of microwave power on the extraction amount of total anthocyanidins

圖 5 甲醇體積分數(shù)對總花青素提取量的影響Figure 5 Effect of methanol concentration on the extraction amount of total anthocyanidins

3.3.3 微波時間對總花青素提取量的影響 由圖6所示：在微波時間為2～20 min時，總花青素的提取量隨微波時間的延長而提高，在20 min時達到最大值；繼續(xù)加長提取時間，提取量則下降。這是由于在一定的微波功率下，微波時間越長，對細胞的破壞越徹底，花青素溶出物越多；但微波時間過長會使高溫對花青素破壞速度大于花青素浸出速度，花青素總提取量降低。因此依據(jù)結果選擇微波時間為10、20和30 min進行響應面實驗。

3.3.4 料液比對總花青素提取量的影響 由圖 7 所示：在料液比為 1∶10 ～ 1∶40 時，總花青素的提取量隨著溶劑量的加大逐漸提高；當料液比為1∶40時，提取量達到最大，而后緩慢下降。這是因為增加溶劑量有利于花青素的溶出，但溶劑增加比溶質增加倍數(shù)過大會稀釋提取液并浪費資源，故提取量下降。依據(jù)研究結果選擇料液比1∶30、1∶40和1∶50進行響應面實驗。

圖 6 微波時間對總花青素提取量的影響Figure 6 Effect of microwave time on the extraction amount of total anthocyanidins

圖 7 料液比對總花青素提取量的影響Figure 7 Effect of solid-liquid ratio on extraction amount of total anthocyanidins

3.4 響應面優(yōu)化結果

3.4.1 響應面實驗設計及結果分析 在單因素實驗結果的基礎上，設計4因素3水平的響應面實驗，以總花青素提取量(Y)為響應值，微波功率(A)、甲醇體積分數(shù)(B)、微波時間(C)和料液比(D)為自變量，共進行29次實驗，其中5次為驗證實驗。將結果運用Design-Expert.V8.0.6.1軟件進行多元回歸擬合，得到回歸方程模型：Y=?10.774 63? 0.017 17A+0.153 27B+0.382 88C+0.175 19D+0.000 78AB+0.000 19AC+0.000 78AD?0.002 40BC+0.001 45BD+0.000 23CD?0.000 06A2?0.003 45B2?0.006 70C2?0.008 43D2。

從表2可知：模型項為極顯著，其中單項因素A、B、C、D與交叉項AB、AD及二次項C2、D2對總花青素提取量的影響達到極顯著水平(P＜0.01)，二次項A2、B2達到顯著水平(P＜0.05)，其余項因素不顯著(P＞0.05)。該模型失擬項不顯著，表明該模型建模成功。其中決定系數(shù)R2為0.95，校正系數(shù)R2Adj為0.90，表明建立的模型與實際情況擬合度較好，可用來進行分析與預測。由表2中F值可知：4個自變量在本研究實驗范圍內對提取量影響從大到小依次為A(微波功率)、D(料液比)、B(甲醇體積分數(shù))、C(微波時間)。

表 2 回歸模型方差分析Table 2 Analysis of variance (ANOVA) of regression model

3.4.2 響應面交互作用結果分析 由圖8可知：微波功率對提取量的影響最為顯著。微波功率與甲醇體積分數(shù)和料液比，兩兩之間交互作用較強，表現(xiàn)為響應面坡度較陡。隨著微波功率的增大，花青素的提取量逐漸增加。其余因素間，交互作用相對較弱，即響應面坡度較緩。根據(jù)所建立的響應面擬合方程進行參數(shù)最優(yōu)分析，所得預測最佳工藝條件為：微波功率640 W，甲醇體積分數(shù)90%，微波時間22.14 min，料液比1∶48.10，在此條件下總花青素提取量為6.83 mg·g?1。結合模型預測最佳條件和實際情況，采用優(yōu)化條件：微波功率640 W，甲醇體積分數(shù)90%，微波時間22 min，料液比1∶48。進行3組平行驗證試驗，其平均提取量為 (6.68 ±0.13) mg·g?1，與理論預測值 6.83 mg·g?1基本一致，表明模型與實際擬合情況較好。因此響應面法對白及花中花青素提取工藝的優(yōu)化具有可行性。

圖 8 各因素交互作用對總花青素提取量影響的響應面圖Figure 8 Response surface plots showing the interactive effects of factors on total anthocyanin extraction

4 結論

本研究采用微波萃取法進行白及花中花青素的提取。在單因素實驗的基礎上，采用響應面分析法進行提取條件的優(yōu)化，并建立了微波功率、甲醇體積分數(shù)、提取時間和料液比對總花青素提取量的二次回歸方程模型。得到最佳的提取工藝條件為：微波功率640 W，甲醇體積分數(shù)90%，微波時間22.14 min，料液比1∶48.10。結合實際情況調整參數(shù)為：微波功率640 W，甲醇體積分數(shù)90%，微波時間22 min，料液比 1∶48。在此條件下，白及花中總花青素的提取量為 (6.68±0.13) mg·g?1，與預測值 6.83 mg·g?1基本吻合。