響應(yīng)面法優(yōu)化糞腸球菌固態(tài)發(fā)酵牛糞生物活性飼料的研究

王巍杰，王彩喆，李慧敏，田美霞，侯余勇，陳方見

(1.華北理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 唐山 063210；2. 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過程工程重點實驗室，天津 300308)

隨著養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，牛糞引起的糞污問題日益嚴(yán)重[1]，合理利用牛糞意義重大。因牛糞中含有蛋白、微量元素、維生素等營養(yǎng)成分，牛糞除用于有機肥、沼氣的應(yīng)用外，還用于黃粉蟲的飼喂[2]和禽畜飼料的開發(fā)[3]。糞腸球菌(糞鏈球菌)屬于動物腸道的正產(chǎn)菌乳酸菌的一類，是農(nóng)業(yè)部規(guī)定可用于飼料微生態(tài)制劑的生產(chǎn)菌源，有抑制禽畜病原菌、抗病害的作用，還能有效調(diào)整動物腸道的菌群平衡，增強免疫力，提高動物存活率[4-6]，鄧夢婷研究日糧中添加糞腸球菌能提高奶牛產(chǎn)奶量，同時降低糞樣中粗蛋白含量[7]。

廢棄酵母是啤酒生產(chǎn)加工中的廢棄物，蛋白含量約占干物質(zhì)的50%，富含核酸、氨基酸、礦物質(zhì)、多種酶等營養(yǎng)物質(zhì)，簡單加工處理后可制成粗蛋白飼料，但禽畜適口性差[8]。該項研究采用糞腸球菌為發(fā)酵菌，以牛糞為主要發(fā)酵原料，配以廢棄啤酒酵母、玉米粉組成固體發(fā)酵培養(yǎng)基基料，探索固體發(fā)酵生物活性菌生物飼料的工藝，制備牛糞深加工飼料，彌補市場上牛糞飼料加工簡單，利用率等不足之處，為牛糞飼料精加工提供新方法。

1 試驗材料與研究方法

1.1 材料與試劑

原料：廢棄啤酒酵母：唐山燕泉啤酒廠提供，烘干溫度60 ℃，粉碎，保存?zhèn)溆?。牛糞：唐山高峪養(yǎng)牛場提供，自然風(fēng)干，粉碎，保存?zhèn)溆谩Ｓ衩酌尜徲谔粕绞惺锕馐袌觥?/p>

菌種：糞腸球菌購于無錫拜弗德生物科技有限公司，活菌含量≥100億個/克。

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基(100 mL)： 酵母粉1.000 g，牛肉膏1 g，胰蛋白胨3 g，碳酸氫鈉 0.2 g，葡萄糖2.8 g，氯化鈉0.2 g，乙酸鈉0.1 g，硫酸鎂0.019 2 g，硫酸錳0.005 0 g。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：牛糞65%，廢棄啤酒酵母20%，玉米粉15%，120 ℃滅菌30 min。

1.3 儀器與設(shè)備

DH3600AB型恒溫培養(yǎng)箱；Primo Star生物顯微鏡；KDN-16C數(shù)顯溫控消化爐；KDN-1000全自動定氮儀；SZF-06C粗脂肪測定儀；CXC-06粗纖維測定儀。

1.4 研究方法

1.4.1 糞腸球菌活化

在無菌條件下，將0.5 g糞腸球菌接種于100 mL滅菌培養(yǎng)基中，35 ℃，120 r/min搖床培養(yǎng)18 h后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 菌數(shù)的測定方法

采用血球計數(shù)板測定活菌數(shù)。

1.4.3 糞腸球菌發(fā)酵牛糞生物飼料的制備方法

稱取200 g固體培養(yǎng)基置于500 mL發(fā)酵瓶中，接種適宜比例的糞腸球液，控制料水比、反應(yīng)時間、發(fā)酵溫度，自然pH下固態(tài)發(fā)酵，測定發(fā)酵飼料活菌總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 料水比對活菌數(shù)的影響

按照標(biāo)題1.4.3的制備方法操作，在控制其他發(fā)酵條件相同的情況下，考察30%、40%、50%、60%、70%、80%料水比對飼料產(chǎn)物中糞腸球菌活菌數(shù)的影響，結(jié)果見圖1。

從圖1結(jié)果可以看出，當(dāng)料水比為60%時，腸球菌活菌數(shù)最大為120×108cfu/g。固態(tài)培養(yǎng)基中水分是影響糞腸球菌正常生長的重要因素，水分過多或過少會干擾菌群的正常生長代謝，使活菌總數(shù)減少。

2.2 接種量對活菌數(shù)的影響

按照標(biāo)題1.4.3的制備方法操作，在料水比為60%時，控制其他發(fā)酵條件相同，分別接種9%、11%、14%、17%、20%的糞腸球進行固態(tài)發(fā)酵，飼料中活菌數(shù)見圖2。

從圖2可以看出，在接種量為9%～20%的范圍內(nèi)，隨著接種量的增多，活菌數(shù)相應(yīng)增加，當(dāng)增加到14%時不再增長而呈下降趨勢，最大活菌數(shù)為500×108cfu/g。

2.3 溫度對活菌數(shù)的影響

按照標(biāo)題1.4.3的制備方法操作，接種14%的糞腸球菌，料水比為60%，控制相同發(fā)酵時間，分別考察發(fā)酵溫度25 ℃、30 ℃、33 ℃、35 ℃、37 ℃對發(fā)酵飼料活菌數(shù)的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 發(fā)酵溫度對飼料中活菌數(shù)的影響

圖3結(jié)果顯示，當(dāng)溫度在25～37 ℃之間時，隨著發(fā)酵溫度升高糞腸球菌活菌數(shù)增至最大，隨后下降。當(dāng)溫度為33 ℃時，發(fā)酵飼料活菌數(shù)最大為200×108cfu/g。不同發(fā)酵溫度對糞腸球菌生長影響顯著，溫度過低，糞腸球菌生長緩慢，溫度高于菌體適宜生長溫度，會使糞腸球菌出現(xiàn)異常生長，甚至死亡，活菌總數(shù)降低。

2.4 時間對活菌數(shù)的影響

按照標(biāo)題1.4.3的制備方法操作，在接種14%的糞腸球菌、料水比為60%、發(fā)酵溫度溫度33 ℃條件下，分別考察發(fā)酵時間48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h和192 h對發(fā)酵飼料活菌數(shù)的影響，試驗結(jié)果見圖4。

圖4 發(fā)酵時間對飼料中活菌數(shù)的影響

圖4結(jié)果顯示，當(dāng)發(fā)酵時間為120 h，發(fā)酵飼料中糞腸球菌數(shù)達到最高值378×108cfu/g。發(fā)酵時間低于或高于120 h，糞腸球菌數(shù)呈不同程度降低。隨著發(fā)酵時間的增加，營養(yǎng)成分逐漸減少、pH發(fā)生改變，會使菌體逐漸死亡，活菌數(shù)減少。

2.5 響應(yīng)面的試驗結(jié)果及分析

2.5.1回歸模型的建立及分析

依據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Box-Behnken設(shè)計接種量、料水比、發(fā)酵溫度3因素和相應(yīng)的3水平響應(yīng)面試驗，發(fā)酵時間均為120 h，響應(yīng)面值為活菌數(shù)(108×cfu/g)，實驗因素與試驗水平、響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果、方差分析分別見表1～表3。

表1 實驗因素與試驗水平

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 回歸方程方差分析

由表3可知，該回歸模型p<0.000 1，表現(xiàn)為極顯著，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.996 1，失擬項p=0.969 7，表現(xiàn)為不顯著。模型的相關(guān)系數(shù)實驗交互作用結(jié)果表明該回歸模型擬合情況良好，該模型具有統(tǒng)計學(xué)意義，其中接種量、料水比、發(fā)酵溫度，接種量與料水比、接種量與發(fā)酵溫度、料水比與發(fā)酵溫度的交互作用，均對糞腸球菌發(fā)酵飼料的效果作用顯著。響應(yīng)面各因素交互作用的影響見圖5～圖7，交互作用的顯著程度可以通過彎曲程度顯示。

圖5 接種量(A)和料水比(B)的交互作用響應(yīng)面圖與等值線

圖6 接種量(A)和發(fā)酵溫度(C)的交互作用響應(yīng)面圖與等值線

圖7 料水比(B)和發(fā)酵溫度(C)的交互作用響應(yīng)面圖與等值線

經(jīng)回歸分析，得到糞腸球菌固態(tài)發(fā)酵活菌數(shù)模型的三元二次方程：Y=-8 808.900 00+323.275 00A+121.210 00B+204.216 67C+0.900 00AB+8.000 00AC+2.100 00BC-22.550 00A2-1.668 00B2-6.633 33C2。

2.5.2 最佳工藝條件的確定及驗證

通過回歸模型預(yù)測，得到糞腸球菌固態(tài)發(fā)酵生物活性飼料的最佳工藝條件為：接種量14.39%、料水比61.50%、發(fā)酵溫度33.84 ℃?？紤]實際實驗可操作性，將上述最優(yōu)條件更改為接種量14%、料水比62%、發(fā)酵溫度34 ℃，活菌數(shù)的理論最高值為696.324×108cfu/g。在最佳發(fā)酵條件下經(jīng)3次平行實驗驗證得到活菌數(shù)為685×108cfu/g，與模型的理論值相差1.0%，說明模型與實際情況比較吻合，可行性較好。

3 結(jié)論

(1)采用牛糞、廢棄啤酒酵母、玉米粉為原料，以糞腸球菌活菌數(shù)為指標(biāo)，在單因素基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法優(yōu)化糞腸球菌固態(tài)發(fā)酵牛糞生物活性飼料的條件，建立了接種量、料水比、發(fā)酵溫度三因素的三元二次方程，實驗驗證結(jié)果表明模型合理可行。

(2)確定糞腸球菌固態(tài)發(fā)酵牛糞生物活性飼料的最佳工藝條件為：接種量14%、料水比62%、發(fā)酵溫度34 ℃，發(fā)酵時間120 h，此條件下發(fā)酵制備飼料，糞腸球菌活菌數(shù)總數(shù)為685×108cfu/g，活菌總數(shù)與理論值基本相符，預(yù)測的模型可行性良好。