苦木注射液聯(lián)用影響阿奇霉素細(xì)菌耐藥的體外研究

張 杰,孫發(fā)鑫,郭文娜,許曉蒙,楊 昕,許 卉

(1.煙臺大學(xué)新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心、分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室(煙臺大學(xué)),山東 煙臺,264005;2.煙臺大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,山東 煙臺,264005)

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素阿奇霉素抗菌譜廣,對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌均具較好抑菌效果,臨床上廣泛用于治療敏感菌所致呼吸道、皮膚和軟組織感染[1-3]．但由于抗生素濫用廣泛,阿奇霉素耐藥率逐年上升,給臨床抗感染治療帶來巨大挑戰(zhàn)[4]．應(yīng)對阿奇霉素耐藥,采用與清熱解毒類中藥制劑聯(lián)合應(yīng)用[5-6],可有效改善臨床治療效果．

苦木注射液是以苦木的莖和枝為原料,經(jīng)乙醇提取和反復(fù)酸堿調(diào)節(jié)制成的單方制劑,具有清熱、解毒、消炎作用,用于感冒、上呼吸道感染、細(xì)菌性痢疾等疾病的臨床治療[7]．苦木注射液中包含多種苦木生物堿,目前已有研究表明苦木生物堿對金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、溶血性鏈球菌具有抑制作用[8],但苦木注射液抑菌作用研究基礎(chǔ)薄弱且無聯(lián)合用藥相關(guān)研究．本課題研究阿奇霉素與苦木注射液聯(lián)合對阿奇霉素常見耐藥致病菌的體外抑制作用,評價分析藥物聯(lián)合抑菌相互作用．

1 材料與方法

1.1 試劑與菌株

注射用阿奇霉素(山東羅欣藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司;批號:518013152)、苦木注射液(江西青峰藥業(yè)有限公司;批號:2019063103)、血平板(環(huán)凱微生物有限公司)、M-H肉湯培養(yǎng)基(北京三藥科技開發(fā)公司)、瓊脂培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)股份有限公司),金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(CMCC(B)26003)、肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(CMCC(B)31001)、乙型溶血性鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(CMCC(B)32210)、痢疾志賀菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(CMCC(B)51252)、肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(CMCC(B)46117)、大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(CMCC(B)44103)、銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(CMCC(B)10211),均購自中國食品藥品檢定研究院．

1.2 儀器

恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司),超凈臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司),細(xì)菌計數(shù)儀(杭州澤析生物科技有限公司),高壓滅菌器(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司).

1.3 方法

1.3.1 菌懸液制備 用接種環(huán)挑取平板少量菌落,接種于液體培養(yǎng)基,放于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18～24 h． 用無菌生理鹽水進(jìn)行稀釋,配制成5×105CFU/mL的菌懸液,用于MIC及FIC測定．

1.3.2 體外抑菌實驗 96孔板微量肉湯培養(yǎng)法測定標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、痢疾志賀菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌最小抑菌濃度(MIC)．選用倍比稀釋法稀釋藥物濃度,藥物濃度設(shè)定如下:阿奇霉素為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 l、0.125 μg/mL;苦木注射液(以苦木總生物堿計):為4000、2000、1000、500、250、125、62.5、31.25 μg/mL[9]．每孔體積200 μL(100 μL藥物+100 μL培養(yǎng)基),37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),24 h后黑色背景下肉眼觀察結(jié)果,以無菌生長的溶液清晰透亮的最低濃度孔藥物濃度為MIC．

1.3.3 聯(lián)合抑菌實驗 選用96孔板微量肉湯稀釋棋盤法測定部分抑菌指數(shù)(FIC)．阿奇霉素與苦木注射液各50 μL聯(lián)合,96孔板中(1—7行第1—7孔按阿奇霉素濃度4 MIC～1/16 MIC依次加入;1—7列第1—7孔按苦木注射液濃度4 MIC～1/16 MIC依次加入),同時設(shè)定陰性對照孔(200 μL液體培養(yǎng)基)以及陽性對照孔(100 μL菌懸液+100 μL液體培養(yǎng)基)．將37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),24 h后黑色背景下肉眼觀察結(jié)果,無菌生長的溶液清晰透亮的最低濃度孔藥物濃度為聯(lián)用MIC．FIC=聯(lián)用MIC阿奇霉素/單用MIC阿奇霉素+聯(lián)用MIC苦木注射液/單用MIC苦木注射液．FIC≤0.5為協(xié)同作用;0.52為拮抗作用[10]．

1.3.4 體外誘導(dǎo)耐藥 采用體外遞增藥物濃度法誘導(dǎo)制備阿奇霉素高度耐藥菌[11],將原菌液稀釋至密度為1×107CFU/mL,取50 μL分別接種于阿奇霉素濃度依次為MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC的含藥液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果．取有菌株生長的最高濃度含藥培養(yǎng)基100 μL均勻涂布于相同含藥濃度平板,37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后觀察是否有菌落生長．挑取含藥平板菌落接種于無藥液體培養(yǎng)基中制備原菌液,完成第一代誘導(dǎo)．以第一代誘導(dǎo)菌株的最高濃度作為中間值,按上述方法繼續(xù)類推誘導(dǎo),直至各菌株耐受256 μg/mL藥物濃度,即停止誘導(dǎo)．將菌液涂布于相同濃度平板,37 ℃培養(yǎng)24 h后,挑取單菌落于無藥液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳代3次,進(jìn)行細(xì)菌敏感性實驗．

2 結(jié) 果

2.1 阿奇霉素聯(lián)合苦木注射液對標(biāo)準(zhǔn)菌株體外MIC及FIC結(jié)果

阿奇霉素單用藥組MIC測定結(jié)果表明,阿奇霉素對金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、痢疾志賀菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希氏菌有相對較強(qiáng)的抑制作用;苦木注射液單用藥組MIC測定結(jié)果表明,苦木注射液對肺炎克雷伯菌及乙型溶血性鏈球菌具相對較強(qiáng)的抑制作用;阿奇霉素與苦木注射液聯(lián)用后MIC值較單藥組相比均有明顯降低(銅綠假單胞菌除外),阿奇霉素聯(lián)用MIC較單用組相比整體降低2～8倍,苦木注射液聯(lián)用MIC較單用MIC降低4～15倍,聯(lián)合用藥對肺炎克雷伯菌作用最顯著．計算藥物聯(lián)用FIC值,金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、痢疾志賀菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希氏菌的FIC≤0.5,具藥物聯(lián)用協(xié)同抑菌作用;測定乙型溶血性鏈球菌FIC范圍為0.5

2.2 體外誘導(dǎo)耐藥結(jié)果

選用7種菌株中藥物聯(lián)合具協(xié)同抑制作用的5種菌株(金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、痢疾志賀菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希氏菌),應(yīng)用體外遞增藥物濃度的方法進(jìn)行人工誘導(dǎo)阿奇霉素耐藥菌株．測定體外誘導(dǎo)阿奇霉素耐藥菌株MIC,結(jié)果表明阿奇霉素對5種株菌的MIC均高于256 μg/mL．根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)判斷,5種菌株對阿奇霉素產(chǎn)生高度耐藥．

2.3 阿奇霉素聯(lián)合苦木注射液對高度耐藥菌株體外MIC及FIC結(jié)果

與標(biāo)準(zhǔn)菌株MIC測定結(jié)果相比,苦木注射液對系列阿奇霉素高度耐藥菌株的MIC值未出現(xiàn)改變;阿奇霉素與苦木注射液聯(lián)用后MIC值分別較單藥組有明顯降低,阿奇霉素聯(lián)用MIC比單用MIC降低4～8倍,苦木注射液聯(lián)用MIC比單用MIC降低4～8倍,聯(lián)合用藥對肺炎克雷伯菌及金黃色葡萄球菌體外抑菌作用最顯著．根據(jù)藥物聯(lián)用FIC值,5種菌株FIC值范圍均為 FIC≤0.5,表現(xiàn)為藥物聯(lián)用協(xié)同抑菌作用,結(jié)果如表2所示．

表1 阿奇霉素與苦木注射液單用及聯(lián)用對標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC與FIC

表2 阿奇霉素與苦木注射液單用及聯(lián)用對高度耐藥菌株的MIC和FIC(n=30)

3 討 論

目前抗生素類藥物聯(lián)合中藥制劑改善耐藥在臨床上已非常普遍,主要選擇依據(jù)是中藥制劑相對于抗生素類藥物具有多靶點、多通路的抗菌作用機(jī)制．中西藥聯(lián)合可顯著提高抗生素療效,擴(kuò)大抗菌譜,發(fā)揮各自優(yōu)勢,降低副作用[12]．

依據(jù)7種標(biāo)準(zhǔn)菌株的FIC 測定結(jié)果,評價兩藥聯(lián)合僅對銅綠假單胞菌呈無關(guān)作用,對其他6種菌株均表現(xiàn)為協(xié)同/相加作用,可顯著降低阿奇霉素MIC值,表明阿奇霉素聯(lián)合苦木注射液具有較強(qiáng)的體外抑菌活性．同時評價阿奇霉素與苦木注射液聯(lián)用對耐藥菌株體外抑制作用,與標(biāo)準(zhǔn)菌株MIC測定結(jié)果相比,苦木注射液單用藥組對系列阿奇霉素高度耐藥菌株的MIC值未改變,表明誘導(dǎo)阿奇霉素高度耐藥不改變苦木注射液對相應(yīng)菌株的抑菌作用;依據(jù)5種高度耐藥菌株MIC值測定結(jié)果,表明兩藥聯(lián)用能顯著降低高度耐藥菌MIC值至32 μg/mL、64 μg/mL,有效改善阿奇霉素耐藥性．

4 結(jié) 論

阿奇霉素聯(lián)合苦木注射液對高度耐藥菌株金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、痢疾志賀菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希氏菌具協(xié)同抑制作用,對肺炎克雷伯菌聯(lián)合抑菌作用最顯著．鑒于本實驗僅為體外抑菌實驗,對體內(nèi)阿奇霉素與苦木注射液聯(lián)用藥物-藥物相互作用有待進(jìn)一步研究．