脂肪組織來源細(xì)胞再生技術(shù)在整形修復(fù)領(lǐng)域中的研究進(jìn)展

黃蓉，范金財(cái)

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院整形外科醫(yī)院整形九科，北京 100144)

脂肪移植在臨床的應(yīng)用達(dá)100多年，1893年有學(xué)者在第23屆德國(guó)外科年會(huì)上報(bào)道了第一例成功的脂肪移植，將小塊脂肪組織移植用于面部軟組織缺損的矯正[1]。20世紀(jì)80年代，Illouz[2]引入吸脂技術(shù)抽取脂肪，使脂肪移植得到了進(jìn)一步的發(fā)展。而后，Coleman[3]對(duì)脂肪移植技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)。傳統(tǒng)的脂肪移植分為兩類，即大脂肪細(xì)胞團(tuán)移植和細(xì)小脂肪細(xì)胞團(tuán)移植，兩者的脂肪顆粒大小雖然有區(qū)別，但均含有成活的脂肪細(xì)胞[4-5]。2001年，Zuk等[6]首次在脂肪組織中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞，與骨髓中分離出的干細(xì)胞相似，稱為脂肪源性干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)，ADSCs成為再生醫(yī)學(xué)中的研究熱點(diǎn)。隨后，Matsumoto等[7]發(fā)現(xiàn)，從脂肪組織中分離出的基質(zhì)血管成分(stromal vascular fraction，SVF)可提高脂肪移植物的存活率，繼而開發(fā)了細(xì)胞輔助脂肪移植技術(shù)，標(biāo)志著自體脂肪細(xì)胞移植的開端。2013年，Tonnard等[8]提出了納米脂肪移植的概念，發(fā)現(xiàn)細(xì)針頭注射納米脂肪不僅可治療面部淺表皺紋等問題，還具有巨大的再生潛能。近年來，脂肪組織來源細(xì)胞再生技術(shù)在整形修復(fù)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)就脂肪組織來源細(xì)胞再生技術(shù)在整形修復(fù)領(lǐng)域中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 脂肪組織來源細(xì)胞的分類

1.1納米脂肪及其衍生物 納米脂肪大小為400～600 μm，甚至更小。2013年，Tonnard等[8]首次報(bào)道了納米脂肪，制備方法為：先用側(cè)孔直徑為1 mm的吸脂針抽吸脂肪，再用0.9%氯化鈉溶液沖洗，然后進(jìn)行機(jī)械乳化，即在2個(gè)10 mL注射器間將抽取到的顆粒脂肪反復(fù)來回推注30次，最后用0.5 mm孔徑的尼龍紗布過濾。此后，諸多學(xué)者在Tonnard法的基礎(chǔ)上，對(duì)納米脂肪制備過程進(jìn)行調(diào)整，從而得到不同的細(xì)胞產(chǎn)品。Lo Furno等[9]省略制備納米脂肪的最后一個(gè)步驟——過濾，其他制備流程不變，設(shè)計(jì)制備了二代納米脂肪，比較兩種納米脂肪中ADSCs的細(xì)胞活性、密度以及增殖率的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二代納米脂肪中ADSCs的水平更高。同樣，為了提高ADSCs水平，Pallua等[10]在Tonnard法基礎(chǔ)上分別在機(jī)械乳化的前后各增加1次離心，并將最終產(chǎn)物命名為脂肪濃縮物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脂肪濃縮物中的確含有高濃度的ADSCs和內(nèi)皮祖細(xì)胞。Gu等[11]在制得納米脂肪后，再將其以3 000 r/min速度離心3 min，以去除油層和水分，進(jìn)而得到濃縮納米脂肪。脂肪移植后存活率較低是困擾整形外科醫(yī)師的難題，為提高移植后脂肪存活率，Bi等[12]首先通過Ⅰ型膠原酶化學(xué)消化，再進(jìn)行離心，從而避免了機(jī)械乳化對(duì)納米脂肪內(nèi)脂肪細(xì)胞活性的破壞，最終獲取脂肪產(chǎn)物——納米活性脂肪，經(jīng)過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，納米活性脂肪的吸收率低于納米脂肪。Zheng等[13]提出了脂肪提取物的概念，將納米脂肪以1 200 r/min離心5 min，發(fā)現(xiàn)脂肪提取物既可促進(jìn)新生血管形成，也可通過減少細(xì)胞內(nèi)活性氧類的堆積實(shí)現(xiàn)脂肪提取物對(duì)脂肪細(xì)胞的抗凋亡作用，從而提高脂肪移植存活率。結(jié)合脂肪提取物和納米活性脂肪在提高脂肪存活率中的積極作用，脂肪提取物或納米活性脂肪聯(lián)合脂肪細(xì)胞移植可能成為一種具有臨床應(yīng)用潛力的新技術(shù)。

以上改良版納米脂肪的初衷大多是提高納米脂肪中ADSCs或SVF水平，實(shí)驗(yàn)室研究或臨床應(yīng)用也證實(shí)了制備方式的改變對(duì)納米脂肪特性及臨床效果的積極影響，但目前隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)較少，證據(jù)等級(jí)較低，很難明確它們的實(shí)際療效。此外，Stuzin[14]認(rèn)為，“納米脂肪”這一專業(yè)術(shù)語的準(zhǔn)確性值得懷疑，Tonnard方法制備的納米脂肪并未達(dá)到納米級(jí)，將其稱為超微米脂肪更為準(zhǔn)確。

1.2SVF SVF是從皮下脂肪提取的去除白色脂肪細(xì)胞的細(xì)胞群，包括內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及大量間充質(zhì)干細(xì)胞等，但不含脂肪細(xì)胞[15]。目前制備SVF常用的方法包括酶消化法和機(jī)械乳化法。酶消化法是指用含有膠原酶的緩沖液在37 ℃環(huán)境下消化脂肪，消化時(shí)間因研究人員的習(xí)慣而各有不同，膠原酶可破壞細(xì)胞外基質(zhì)的膠原纖維，一旦開始分離出不同的細(xì)胞成分，即對(duì)酶消化后的產(chǎn)物進(jìn)行離心分離，最后獲取的提取液可分為三層，其中最下層的沉淀即為SVF[16]。機(jī)械乳化法是指Tonnard制備納米脂肪所采用的方法，SVF與納米脂肪的成分基本一致，稍有不同的是納米脂肪內(nèi)包含破碎的脂肪細(xì)胞碎片；不含酶的機(jī)械分離法在干細(xì)胞分離中的效率大大降低，且不同設(shè)備制得的SVF中干細(xì)胞和殘留酶存在巨大差異[17]。盡管臨床經(jīng)驗(yàn)證明了注射膠原酶的安全性，但謹(jǐn)慎起見，仍應(yīng)在回注前從細(xì)胞制劑中去除所有可測(cè)量的活性酶。由于SVF無需體外擴(kuò)增而含有干細(xì)胞，被視為細(xì)胞再生的理想材料[18]。

1.3ADSCs ADSCs是間充質(zhì)干細(xì)胞的一種。ADSCs 可分化為多個(gè)胚胎譜系，其中最重要的是中胚層譜系[19]。ADSCs不僅可分化為多種類型細(xì)胞，還具有重要的旁分泌特性，通過信號(hào)通路的調(diào)節(jié)減少瘢痕組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)[20]。ADSCs的旁分泌作用還可減少紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，縮短人真皮成纖維細(xì)胞的亞G1期[21]。目前尚未鑒定出ADSCs的單一標(biāo)記，國(guó)際再生治療學(xué)會(huì)認(rèn)為，CD73、CD90和CD105是表征間充質(zhì)干細(xì)胞的最低標(biāo)準(zhǔn)[22]。目前國(guó)內(nèi)外尚缺乏生產(chǎn)ADSCs的標(biāo)準(zhǔn)流程和質(zhì)量管理規(guī)范，導(dǎo)致ASDCs的應(yīng)用面臨極大制約。目前推薦的制備ADSCs的方法是用酶消化脂肪抽吸物，然后離心得到SVF，接種SVF至培養(yǎng)瓶中，設(shè)定培養(yǎng)條件為5%CO2、37 ℃，進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，保持濕度；細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)可以傳代，收集消化的細(xì)胞懸液，接種至培養(yǎng)瓶中，隨后進(jìn)行傳代培養(yǎng)[23]。

與制備而來的純粹的ADSCs相比，SVF的特點(diǎn)是不僅包含ADSCs，還包含內(nèi)皮祖細(xì)胞、造血祖細(xì)胞和白細(xì)胞等其他細(xì)胞類型[24-25]，但不含脂肪細(xì)胞。而納米脂肪的特點(diǎn)為不僅包含與細(xì)小脂肪細(xì)胞團(tuán)數(shù)量相當(dāng)?shù)腁DSCs，還包括破碎的脂肪細(xì)胞以及其他脂肪組織的基質(zhì)成分[12]。由此看來，SVF和納米脂肪成分基本一致，稍有不同的是納米脂肪內(nèi)雖無活的脂肪細(xì)胞，但包含破碎的脂肪細(xì)胞碎片。

2 臨床應(yīng)用和實(shí)驗(yàn)室研究

2.1減輕瘢痕 導(dǎo)致瘢痕的常見原因有外傷、手術(shù)等，一直以來瘢痕治療受各種因素的限制，治療效果欠佳。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)因子可通過調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞增殖抑制膠原合成，實(shí)現(xiàn)抗纖維化，而重要的調(diào)節(jié)因子包括細(xì)胞外基質(zhì)中的基質(zhì)金屬蛋白酶以及金屬蛋白酶組織抑制劑[26]。ADSCs可合成和分泌細(xì)胞因子，為脂肪組織來源細(xì)胞再生技術(shù)應(yīng)用于瘢痕治療提供了理論基礎(chǔ)。Tenna等[27]選擇30例面部萎縮性痤瘡瘢痕患者作為研究對(duì)象，給予皮下注射納米脂肪聯(lián)合富血小板血漿，結(jié)果顯示，無論是否聯(lián)合應(yīng)用CO2激光，納米脂肪聯(lián)合富血小板血漿皮下注射均具有積極的臨床療效。Uyulmaz等[28]應(yīng)用納米脂肪治療40例外傷導(dǎo)致的瘢痕患者，具體瘢痕類型不詳，治療后患者滿意度達(dá)92%。然而，目前納米脂肪中減輕瘢痕的成分尚不明確，需進(jìn)一步研究將潛在的ADSCs介導(dǎo)的作用與其他因素分開。另外，在一組前瞻性病例研究中，Gu等[11]應(yīng)用濃縮納米脂肪聯(lián)合結(jié)構(gòu)脂肪治療20例患者(共計(jì)25例面部萎縮性瘢痕)，患者與觀察者瘢痕評(píng)估表評(píng)分顯示，患者對(duì)術(shù)后瘢痕改善效果滿意，且組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)術(shù)前不存在皮脂腺和汗腺的瘢痕組織在注射后出現(xiàn)了皮脂腺和汗腺，推測(cè)可能是濃縮納米脂肪中的ADSCs促進(jìn)了皮脂腺和汗腺再生，促使瘢痕組織向正常皮膚轉(zhuǎn)化。Gentile等[29]將Tonnard法納米脂肪和三種改良納米脂肪進(jìn)行比較，并將四種納米脂肪應(yīng)用于43例燒傷或創(chuàng)傷后瘢痕患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，增壓改良的納米脂肪中SVF水平最高，經(jīng)過團(tuán)隊(duì)評(píng)估和患者自評(píng)后發(fā)現(xiàn)，增壓改良的納米脂肪可減輕瘢痕，臨床評(píng)價(jià)最佳，且納米脂肪中SVF水平與臨床療效呈正相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，Zhang等[30]在增生性瘢痕模型的兔耳內(nèi)注射ADSCs，發(fā)現(xiàn)ADSCs可通過減少α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和Ⅰ型膠原基因的表達(dá)，改善膠原蛋白沉積，減輕兔耳增生性瘢痕的形成。

脂肪組織來源細(xì)胞再生技術(shù)在減輕瘢痕的應(yīng)用中作用顯著，但由于很難確定每種再生技術(shù)的有效劑量，無法并列比較它們臨床作用的優(yōu)劣。但多項(xiàng)對(duì)比研究顯示，瘢痕效果的改善與SVF水平密切相關(guān)，相較于ADSCs，SVF的臨床效果更佳[16，31-32]。ADSCs單獨(dú)應(yīng)用時(shí)不具備體積填充的作用，因此不適用于凹陷型瘢痕等瘢痕類型的治療，而納米脂肪及SVF因富含ADSCs，可起到糾正輕微體積缺損等作用，因而應(yīng)用范圍更廣泛。調(diào)整納米脂肪的制備程序后發(fā)現(xiàn)，納米脂肪制備中任何一個(gè)步驟的改變均可影響SVF的水平，繼而改變臨床效果[29]，提示未來應(yīng)進(jìn)一步詳細(xì)分解納米脂肪制備過程，在制備流程簡(jiǎn)易化的同時(shí)尋求SVF的高產(chǎn)量。此外，Vallejo等[33]認(rèn)為，脂肪填充時(shí)由于脂肪內(nèi)的ADSCs具有旁分泌等作用，可能會(huì)干擾腫瘤生物學(xué)，因此將脂肪填充應(yīng)用于惡性腫瘤切除術(shù)后的瘢痕患者時(shí)，難以排除ADSCs由于分泌生長(zhǎng)因子等而引起腫瘤復(fù)發(fā)的可能。而鑒于ADSCs是脂肪組織來源細(xì)胞再生技術(shù)的核心成分，研究者應(yīng)針對(duì)ADSCs對(duì)腫瘤生物學(xué)的影響加強(qiáng)基礎(chǔ)研究，明確脂肪組織來源細(xì)胞再生技術(shù)的禁忌證。

2.2面部年輕化 皮膚老化主要表現(xiàn)為皺紋、色素沉著、皮膚松弛萎縮等，這些表現(xiàn)主要由內(nèi)在因素(基因、激素)和外在因素(紫外線、吸煙)等共同造成[34]。脂肪組織來源細(xì)胞再生技術(shù)可促進(jìn)膠原蛋白重新合成，減少彈性組織變性。Tonnard等[8]應(yīng)用納米脂肪注射治療67例患者的淺表皺紋，療效顯著且術(shù)后未見感染、脂肪囊腫等并發(fā)癥，僅在大面積注射部位出現(xiàn)短暫紅斑，但僅持續(xù)1.5～2 d，提示納米脂肪可促進(jìn)正常的真皮和表皮基質(zhì)結(jié)構(gòu)的恢復(fù)；另外，應(yīng)用納米脂肪治療黑眼圈也取得了良好的效果。然而，考慮到不同分型黑眼圈病因有所不同，李聰?shù)萚35]認(rèn)為，納米脂肪僅對(duì)血管性黑眼圈和部分結(jié)構(gòu)性黑眼圈療效顯著，而對(duì)于色素性黑眼圈以及混合型黑眼圈療效有限。

Wei等[36]比較了62例聯(lián)合應(yīng)用納米脂肪、富血小板纖維蛋白和結(jié)構(gòu)脂肪移植的試驗(yàn)組患者和77例接受傳統(tǒng)自體脂肪移植的對(duì)照組患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，納米脂肪參與的試驗(yàn)組面部軟組織凹陷癥狀和皮膚質(zhì)地均較傳統(tǒng)脂肪移植組有較大改善，納米脂肪組總體滿意率達(dá)90%以上，且移植區(qū)脂肪組織長(zhǎng)期存活，多數(shù)患者無須多次重復(fù)注射。隨后，Liang等[37]比較了接受納米脂肪和皮內(nèi)富血小板纖維蛋白聯(lián)合注射的103例面部皮膚老化患者和接受透明質(zhì)酸注射的128例面部皮膚老化患者的治療效果，結(jié)果顯示，接受納米脂肪和皮內(nèi)富血小板纖維蛋白聯(lián)合注射的患者面部皮膚老化的改善大于接受透明質(zhì)酸注射者，考慮可能是富血小板纖維蛋白可持續(xù)釋放生長(zhǎng)因子，刺激ADSCs的增殖和旁分泌功能，增加了真皮生長(zhǎng)因子的濃度。Amirkhani等[34]給16例患者的鼻唇溝注射了自體SVF，并評(píng)估注射后鼻唇褶的改善情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SVF治療后皮膚真皮密度和厚度均顯著增加；值得注意的是，注射后1周內(nèi)并未檢測(cè)到注射細(xì)胞，表明SVF的旁分泌機(jī)制主要負(fù)責(zé)真皮結(jié)構(gòu)的變化，而并不參與構(gòu)成組織的結(jié)構(gòu)成分，由此推測(cè)，SVF治療效果的一個(gè)潛在機(jī)制可能是補(bǔ)充CD44，CD44是一種透明質(zhì)酸受體，CD44的減少與皮膚老化相關(guān)，可導(dǎo)致真皮層密度降低。

在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，Zheng等[38]成功建立光老化裸鼠模型，并將每只小鼠背部分為4個(gè)區(qū)域，隨機(jī)注射傳統(tǒng)納米脂肪、離心后中間層納米脂肪、離心后下層納米脂肪或0.9%氯化鈉注射溶液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，離心后下層納米脂肪中SVF及ADSCs的濃度最高，改善小鼠光老化效果最佳。由于納米脂肪和SVF中均不含成活的脂肪細(xì)胞，目前面部年輕化的進(jìn)展得益于再生醫(yī)學(xué)中的干細(xì)胞移植技術(shù)。雖然脂肪組織來源細(xì)胞再生技術(shù)對(duì)面部年輕化具有積極療效，但從脂肪組織中分離ADSCs和SVF涉及酶消化，需對(duì)其生產(chǎn)過程嚴(yán)格監(jiān)管。與ADSCs和SVF相比，納米脂肪注射除了具備再生潛能，還具有嘴唇、眼瞼等精細(xì)部位的體積填充作用，因此在面部年輕化領(lǐng)域中的應(yīng)用備受矚目。

3 小 結(jié)

納米脂肪、SVF、ADSCs等脂肪組織來源細(xì)胞均具有強(qiáng)大的組織再生和修復(fù)能力。與面部老化的其他治療方法相比，脂肪組織來源細(xì)胞再生技術(shù)可更好地主動(dòng)預(yù)防衰老并維持療效。三種細(xì)胞再生技術(shù)各具特點(diǎn)，但與制備SVF和ADSCs的復(fù)雜操作以及高昂的制備費(fèi)用相比，納米脂肪因制備過程簡(jiǎn)單、便捷，無化學(xué)試劑及酶污染風(fēng)險(xiǎn)而格外具有優(yōu)勢(shì)[14]。目前由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)的脂肪組織來源細(xì)胞的命名法，且療效評(píng)估方法較為多樣，導(dǎo)致脂肪組織來源細(xì)胞再生技術(shù)的臨床應(yīng)用受到諸多限制。此外，脂肪組織來源細(xì)胞再生技術(shù)在減輕瘢痕、促進(jìn)面部年輕化等方面的作用機(jī)制尚不明確，未來仍需進(jìn)一步研究。