陶融型大曲微生物多樣性與揮發(fā)性風(fēng)味成分的相關(guān)性研究

陳蒙恩，侯建光，張振科，韓素娜，李建民，陳偉平，王二英，胡曉龍

（1.河南仰韶酒業(yè)有限公司，河南 三門峽 472400；2.河南仰韶生物科技有限公司，河南 三門峽 472400；3.鄭州輕工業(yè)大學(xué)，河南 鄭州 450002）

中國(guó)白酒歷史悠久，它是以高粱等谷物為原料，以酒曲為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)蒸煮、發(fā)酵、蒸餾等工藝而制成的，因此，酒曲在釀酒過程中扮演著重要的角色[1-3]。固態(tài)法白酒大多采用大曲作為糖化發(fā)酵劑，它蘊(yùn)含了釀酒所需的多種微生物和酶，可促使原料發(fā)生糖化、發(fā)酵和產(chǎn)香等生化反應(yīng)，從而賦予白酒獨(dú)特的風(fēng)味，而大曲中的微生物則是決定大曲品質(zhì)的核心因素[4-7]。研究表明，大曲在白酒釀造過程中不僅提供了大量的釀酒功能微生物，其本身所含有的大量風(fēng)味物質(zhì)或其前體物質(zhì)在釀造過程中亦可直接或間接地進(jìn)入酒體，從而賦予白酒獨(dú)特的風(fēng)味，并對(duì)白酒的質(zhì)量起到關(guān)鍵作用[1，5，8]。目前，對(duì)大曲的研究多趨向于單一的風(fēng)味或微生物指標(biāo)[9]，而對(duì)微生物與風(fēng)味成分之間的相關(guān)性以及如何基于現(xiàn)代檢測(cè)手段，建立更加全面科學(xué)的大曲評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的研究較少。

以往對(duì)大曲微生物的研究多采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法[10]，但該方法自身存在一定缺陷，無法全面地認(rèn)識(shí)大曲中的微生物[11-12]。相比之下，高通量測(cè)序技術(shù)作為新一代測(cè)序手段，可方便快捷地對(duì)樣品中復(fù)雜的微生物菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[9，13-14]，且高通量測(cè)序檢測(cè)到的是樣品中所有微生物的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）序列，能夠更加客觀的反應(yīng)樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)的真實(shí)性[15]。目前，利用高通量技術(shù)對(duì)大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并進(jìn)一步對(duì)大曲的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行相關(guān)性研究已有文獻(xiàn)報(bào)道[16-17]，但對(duì)陶融型大曲[18-19]微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性與揮發(fā)性風(fēng)味成分的相關(guān)性研究尚未見報(bào)道。

本研究采用高通量測(cè)序手段，對(duì)成品陶融型大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行研究，得出陶融型大曲中主要的微生物群落構(gòu)成，并與大曲的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行相關(guān)性分析，為解析陶融型大曲的生香機(jī)理及篩選優(yōu)良釀造功能微生物提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)；同時(shí)，可通過進(jìn)一步研究，將個(gè)別優(yōu)勢(shì)釀酒功能微生物作為優(yōu)質(zhì)大曲的評(píng)判指標(biāo)，結(jié)合原有評(píng)價(jià)體系，有望形成一套更加合理的大曲評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 大曲樣品

對(duì)河南某公司夏季同時(shí)培養(yǎng)的4房陶融型大曲成品進(jìn)行取樣，大曲的培養(yǎng)時(shí)間為30 d，每房曲均采用四點(diǎn)中心法進(jìn)行取樣（大曲在入房培養(yǎng)室時(shí)對(duì)要取樣的曲塊進(jìn)行標(biāo)記，在大曲培養(yǎng)過程中進(jìn)行翻曲、打攏、并房時(shí)仍將其放至指定位置），樣品粉碎后過40目篩，采用四分法濃縮后至于無菌袋內(nèi)4 ℃保存。

1.1.2 主要試劑

DNA Ladder 2000、DL 2000 TMDNA Marker：寶生物工程（大連）有限公司；Soil DNA Kit提取試劑盒：美國(guó)OMEGA公司；蛋白酶K、溶菌酶：美國(guó)Sigma公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒：美國(guó)AxyPrepDNA公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-VS2 型超凈工作臺(tái)：無錫易純凈化設(shè)備有限公司；TGL-20M高速冷凍離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；NanoDrop 2000微量分光光度計(jì)：美國(guó)ThermoFisher公司；GeneAmp?9700 型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國(guó)ABI公司；MX-S型可調(diào)式混勻儀：美國(guó)SCILOGEX公司；QuantiFluorTM-ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)：美國(guó)Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 大曲揮發(fā)性風(fēng)味成分檢測(cè)

利用頂空固相微萃取及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（headspacesolidphasemicroextractionandgaschromatographymass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）[20]對(duì)剛培養(yǎng)成熟的4房陶融型大曲的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行檢測(cè)。

HS-SPME條件：準(zhǔn)確稱取3.0 g大曲樣品置于20 mL頂空瓶中；孵化爐溫度設(shè)為60 ℃，孵化10 min；萃取40 min；進(jìn)樣口溫度設(shè)為260 ℃，解吸2 min；后自動(dòng)進(jìn)行GC-MS分析。

GC-MS條件：毛細(xì)管色譜柱為DB-FFAP（60m×250μm×0.25 μm），260 ℃條件下自動(dòng)不分流進(jìn)樣；程序升溫：35 ℃保持3 min，5 ℃/min升至100 ℃保持3 min，5 ℃/min升至150 ℃保持3min，10℃/min升至230℃保持3 min；載氣：高純度氦氣（He），流速為1.00 mL/min；離子源：電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，傳輸線溫度280 ℃，離子源溫度300 ℃，掃描范圍30～550 u。

定性及半定量：將大曲揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)（NIST05a.L）進(jìn)行對(duì)比鑒定，匹配度＞800的鑒定結(jié)果予以確認(rèn)；以乙酸正丁酯為內(nèi)標(biāo)，將大曲樣品中鑒定的揮發(fā)性化合物的濃度與乙酸丁酯質(zhì)量濃度作比進(jìn)行計(jì)算。

1.3.2 大曲微生物總DNA提取及PCR擴(kuò)增定量

采用Soil DNA Kit對(duì)大曲微生物總基因組DNA進(jìn)行提取，提取方法按照試劑公司提供的實(shí)驗(yàn)操作指南進(jìn)行。利用NanoDrop 2000微量分光光度計(jì)對(duì)提取的微生物DNA濃度及純度進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)合格的DNA提取物置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

PCR采用TransGen AP221-02，TransStart Fastpfu DNA聚合酶，20μL反應(yīng)體系：5×FastPfuBuffer4μL，2.5mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）2 μL；正向引物（5μmol/L）0.8μL；反向引物（5μmol/L）0.8μL；FastPfu聚合酶0.4μL；牛血清蛋白（bovineserumalbumin，BSA）0.2 μL；Template DNA 10 ng；補(bǔ)雙蒸水（ddH2O）至20 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，28個(gè)循環(huán)后；72 ℃延伸10 min，10 ℃保持至停止。每個(gè)樣本按照正式實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，同一樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物合并混合后進(jìn)行電泳檢測(cè)，采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒對(duì)不同樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，Tris HCl洗脫；2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，同時(shí)對(duì)不同大曲樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量。

1.3.3 高通量測(cè)序與數(shù)據(jù)分析

樣本的建庫(kù)和測(cè)序由上海凌恩生物科技有限公司完成。高通量測(cè)序針對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因515F_907R區(qū)域，真菌ITS1F_ITS2R區(qū)序列，設(shè)計(jì)帶核苷酸便簽[21]的特異引物，測(cè)序平臺(tái)為Illumina MiSeq。通過雙末端測(cè)序[22]，將基因序列進(jìn)行初級(jí)篩選，通過barcode找對(duì)應(yīng)編號(hào)樣本，去掉引物，再把質(zhì)量差的序列剔除。通過提取優(yōu)化序列中的非重復(fù)序列，降低分析中間過程冗余計(jì)算量（http：//drive5.com/usearch/manual/dereplication.html）；去除沒有重復(fù)的單序列（http：//drive5.com/usearch/manual/singletons.html）；操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類采用97%的相似性進(jìn)行，去除嵌合體后得到OTU的代表序列。

1.3.4 相關(guān)性分析[23]

數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、繪圖采用Origin9.0軟件、相關(guān)性分析采用SPSS19.0軟件，顯著性水平設(shè)定在5%。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲樣品中揮發(fā)性風(fēng)味成分檢測(cè)

對(duì)剛培養(yǎng)成熟的4房陶融型大曲的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表1。由表1可知，4房大曲共檢測(cè)到45種揮發(fā)性風(fēng)味成分，分為9類，其中酯類化合物種類及含量最高（17種，含量為331.92 μg/g），其次是醇類化合物（7種，含量為273.34 μg/g）、芳香族類化合物（3種，含量為184.88 μg/g）和吡嗪類化合物（4種，含量為65.99 μg/g）。

2.2 高通量原始數(shù)據(jù)獲取及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析[24-25]

通過Illumina PE250高通量測(cè)序篩選獲取有效基因組序列信息，測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)見表2。由表2可知，經(jīng)過分析統(tǒng)計(jì)，4房大曲樣品共獲得細(xì)菌有效序列145 532條，平均長(zhǎng)度在370 bp以上，測(cè)序長(zhǎng)度主要分布在351～400 bp（99.98%）之間，與設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增長(zhǎng)度接近，由此判斷測(cè)序結(jié)果較好。共獲得真菌有效序列149 091條，平均長(zhǎng)度約為280 bp，測(cè)序長(zhǎng)度集中分布在251～300 bp，與設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增序列長(zhǎng)度為300 bp左右較接近，說明本次測(cè)序結(jié)果較合理，保證了足夠的測(cè)序數(shù)量，可以滿足后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

表2 文庫(kù)測(cè)序情況數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of sequences data

2.3 大曲微生物聚類

稀釋曲線可以用來比較測(cè)序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐富度，當(dāng)曲線趨向平緩時(shí)，更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTU，反之則表明繼續(xù)測(cè)序還可能產(chǎn)生較多新的OTU[16]。對(duì)不同樣品之間共有的以及獨(dú)有的OTU數(shù)進(jìn)行疊加，得出4個(gè)大曲樣本中微生物OTU分布的Venn圖[26-28]見圖1。由圖1可知，4房陶融型大曲中共獲得細(xì)菌OTU數(shù)目為68個(gè)，其中共同擁有的OTU數(shù)目為44個(gè)，占OTU總數(shù)的65%；共獲得真菌OTU數(shù)目為47個(gè)，其中共同擁有的OTU數(shù)目為25個(gè)，占OTU總數(shù)的53%。

圖1 大曲文庫(kù)內(nèi)OTU的韋恩圖Fig.1 Venn diagram of OTUs of Daqu libraries

2.4 Shannon指數(shù)和Rank指數(shù)分析

為研究樣品的取樣量能否代表原樣品物種豐富度，對(duì)樣品的個(gè)數(shù)和物種的種類做稀釋分布曲線[29-30]，從而評(píng)估所構(gòu)建的文庫(kù)的覆蓋率是否達(dá)到飽和，結(jié)果見圖2；以97%的序列相似度水平作為OTU的界定，通過分析樣品的OTU數(shù)目及分布情況，來反映樣品中所含種群的多樣性及豐富度；通過Shannon指數(shù)[31]反映樣本中微生物多樣性；Rank-Abundance[32]來解釋樣品物種豐度和物種均勻度，結(jié)果見圖3、圖4。

圖2 樣品稀釋性曲線Fig.2 Rarefaction curve of samples

圖3 樣本的Shannon曲線Fig.3 Shannon curves of samples

圖4 OTU等級(jí)豐度曲線Fig.4 OTU rank-abundance curves

根據(jù)圖2和圖3的結(jié)果可得，各曲樣的稀釋性曲線和Shannon曲線都隨測(cè)序深度的增加呈現(xiàn)先增加后趨于平緩的趨勢(shì)，這表明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，測(cè)序深度能夠反映出樣品中絕大多數(shù)微生物的物種信息。圖2中細(xì)菌文庫(kù)內(nèi)OTU數(shù)目表現(xiàn)為ZW4＞ZW5＞ZW1＞ZW2；真菌文庫(kù)的OTU數(shù)目表現(xiàn)為ZW4＞ZW1＞ZW5＞ZW2，與細(xì)菌文庫(kù)基本一致。從Rank-abundance曲線（圖4）可以看出，細(xì)菌微生物多樣性豐度及均勻度均高于真菌。

2.5 陶融型大曲群落結(jié)構(gòu)組成

對(duì)大曲樣品中微生物OTUs信息豐度進(jìn)行加權(quán)聚類分析[33-34]，結(jié)果見圖5、圖6。由圖5、圖6可知，從獲得的145 532條大曲細(xì)菌優(yōu)質(zhì)序列中可以歸類到7個(gè)門，分別為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、未分類細(xì)菌（Bacteria-Unclassified）。其中變形菌門、厚壁菌門和放線菌門占比較大，分別為52.22%、41.51%和2.52%，厚壁菌門為大曲中的優(yōu)勢(shì)微生物，可能是優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬屬于該門，且厚壁菌門主要由芽孢桿菌綱（Bacilli）和梭菌綱（Clostridia）等微生物組成[35]，具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，能夠在相對(duì)極端的條件保持生長(zhǎng)代謝；放線菌廣泛分布于土壤環(huán)境、海洋環(huán)境、植物體及其他極端自然生態(tài)環(huán)境中，和厚壁菌門相似，也具有極強(qiáng)的耐受性[36]。從獲得的149 091條大曲真菌優(yōu)質(zhì)序列中可以歸類到3個(gè)門，分別為子囊菌門（Ascomycota）、接合菌門（Zygomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）。其中子囊菌門真菌占比最大，達(dá)99.38%，接合菌門和擔(dān)子菌門共占0.62%。

圖5 聚類樹與柱狀圖組合Fig.5 Cluster tree and histogram combination

圖6 微生物群落結(jié)構(gòu)Fig.6 Structure of microbial community

在屬的水平上細(xì)菌共得到40個(gè)屬，將豐度低于1%的合并為一類（Others），由圖6可知，4個(gè)曲樣中豐度較高的為泛菌屬（Pantoea，45.32%）、芽孢桿菌屬（Bacillus，15.15%）、明串珠菌屬（Leuconostoc，10.89%）、克羅諾桿菌屬（Cronobacter，8.36%）、乳桿菌屬（Lactobacillus，6.02%）、魏斯氏菌屬（Weissella，5.02%）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora，1.88%）、嗜熱放線菌（Thermoactinomyces，1.63%）、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia，1.58%）、葡萄球菌屬（Staphylococcus，1.02%）、Mitochondrianorank（1.08%）、乳球菌屬（Lactococcus，0.86%）。4個(gè)曲樣的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為泛菌屬、芽孢桿菌屬、明串珠菌屬、克羅諾桿菌屬、乳桿菌屬和魏斯氏菌屬。

4個(gè)曲樣中，在屬的水平上真菌OTU可歸為28個(gè)屬。真菌群落豐度不如細(xì)菌群落，是因?yàn)榇笄谂囵B(yǎng)過程中頂火溫度超過50 ℃，致使大部分真菌死亡，只有少部分耐熱和嗜熱真菌得以存活[37-38]。4個(gè)曲樣中的優(yōu)勢(shì)真菌屬為嗜熱子囊菌屬（Thermoascus，44.07%）、Unidentified（37.58%）、曲霉屬（Aspergillus，10.04%）、嗜熱真菌屬（Thermomyces，3.79%）、鏈格孢霉屬（Alternaria，1.78%）、泡波曲霉屬（Emericella，1.02%）、威克漢姆酵母（Wickerhamomyces，0.78%）、根毛霉屬（Rhizomucor，0.42%）。

2.6 優(yōu)勢(shì)微生物與大曲風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性分析

大曲優(yōu)勢(shì)微生物與風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性分析結(jié)果見表3。由表3可知，芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）與吡嗪類、芳香族類、酸類、酯類均呈顯著正相關(guān)性（P＜0.05），芽孢桿菌等耐熱微生物是大曲中吡嗪類、芳香族類等風(fēng)味物質(zhì)的主要產(chǎn)生菌，在其他學(xué)者的研究成果中已有報(bào)道[39-43]，這與本研究結(jié)果保持一致；魏斯氏菌屬（Weissella）與吡嗪類、酮類、酸類、酯類均呈顯著正相關(guān)性（P＜0.05），這與現(xiàn)有文獻(xiàn)相一致[44]。通過對(duì)大曲中的微生物和揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)合傳統(tǒng)感官對(duì)大曲的認(rèn)識(shí)，能夠找到感官指標(biāo)與微生物形態(tài)呈現(xiàn)的關(guān)系，如果通過進(jìn)一步研究，將個(gè)別優(yōu)勢(shì)微生物作為大曲評(píng)判的指標(biāo)，結(jié)合原有評(píng)價(jià)體系，能夠形成一套對(duì)大曲更加合理的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

表3 微生物與風(fēng)味成分的相關(guān)性Table 3 Correlation between microbe and flavor component

續(xù)表

3 結(jié)論

大曲是白酒釀造中功能微生物的主要來源，大曲微生物群落結(jié)構(gòu)的組成往往決定著白酒的質(zhì)量。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)成品陶融型大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，結(jié)果表明，剛出房的成品陶融型大曲中細(xì)菌的物種多樣性高于真菌，大曲中共檢測(cè)到細(xì)菌OTU數(shù)為68，真菌OTU數(shù)為47。微生物豐度統(tǒng)計(jì)表明，大曲細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬主要為泛菌屬、芽孢桿菌屬、明串珠菌屬、克羅諾桿菌屬、乳桿菌屬和魏斯氏菌屬六大類，六類菌屬共占大曲細(xì)菌多樣性的90.76%，同時(shí)還檢測(cè)到了糖多孢菌屬、嗜熱放線菌、Mitochondrianorank、乳球菌屬等；大曲的優(yōu)勢(shì)菌屬主要為嗜熱子囊菌屬、曲霉屬、嗜熱真菌屬、鏈格孢霉屬、泡波曲霉屬五大類，五類菌屬共占大曲真菌多樣性的60.70%，同時(shí)還檢測(cè)到了鏈格孢霉屬、泡波曲霉屬、威克漢姆酵母、根毛霉屬等。相關(guān)性分析結(jié)果表明，大曲中厚壁菌門下的芽孢桿菌屬、乳桿菌屬與大曲中吡嗪類、酯類、芳香族類等多數(shù)揮發(fā)性風(fēng)味成分呈顯著正相關(guān)性，說明這兩類微生物是大曲制作過程中風(fēng)味物質(zhì)的主要產(chǎn)生菌，這與以往其他學(xué)者的研究結(jié)果相一致。

開放的制作環(huán)境是大曲微生物的主要來源，獨(dú)特的制曲工藝和地域菌群環(huán)境是造酒陶融型大曲特有微生物菌群構(gòu)成的根本。因此，對(duì)大曲微生物群落結(jié)構(gòu)的構(gòu)成及大曲揮發(fā)性風(fēng)味成分的相關(guān)性進(jìn)行系統(tǒng)研究，將有助于解析陶融型白酒典型風(fēng)格的成因。同時(shí)，可結(jié)合大曲傳統(tǒng)的感官評(píng)價(jià)體系，將個(gè)別優(yōu)勢(shì)釀酒功能微生物作為大曲評(píng)判的指標(biāo)，有望形成一套對(duì)大曲更加合理的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。該研究結(jié)果為解析陶融型大曲揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的形成機(jī)理及完善大曲質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供了新的視角。