促煙草種子萌發(fā)的細(xì)菌菌株篩選及促生特性研究

彭玉龍，張乾申，韓麗珍*，孟 源

（1.貴州省遵義市煙草公司，貴州 遵義 563000；2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025）

煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，種植面積已經(jīng)超過130 萬hm2，居世界首位[1]。在煙草栽培中，提高煙苗素質(zhì)、培育無病壯苗是優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)的基礎(chǔ)；而如今烤煙育苗普遍存在煙苗參差不齊、移栽緩苗時(shí)間較長(zhǎng)的狀況。因而，提高煙草種子萌發(fā)率、增強(qiáng)幼苗生長(zhǎng)能力對(duì)提高煙葉質(zhì)量意義重大。從不同植物組織、根際或土壤中分離的有益細(xì)菌可以通過合成促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)發(fā)育的吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）和與植物根際營(yíng)養(yǎng)相關(guān)的鐵載體，溶解土壤中的難溶性磷鉀等促進(jìn)幼苗的生長(zhǎng)[2]。芽孢桿菌具有分泌IAA 等促生特性，已作為重要的微生物資源，在生物肥料領(lǐng)域備受關(guān)注。閆寒等[3]發(fā)現(xiàn)從吉煙9 號(hào)烤煙的根、莖、葉分離到的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌菌株為芽孢桿菌屬，這與黃智華等[4]、劉曉璐等[5]的報(bào)道相一致。而從攀枝花烤煙分離到的62 株內(nèi)生固氮菌中，有6 株芽孢桿菌菌株還具有產(chǎn)IAA 的能力[6]。本項(xiàng)目組在前期研究中，為了解決貴州植煙土壤黏重、增施有機(jī)肥后土壤氮素生物有效性不高的問題，從貴州煙區(qū)土壤中已經(jīng)篩選到2 株高效的氨化芽孢桿菌菌株BacillustoyonensisAMM-2 和B.mobilisAMM-5[7]，但其是否具有促生能力尚未可知。此外，實(shí)驗(yàn)室前期從茶樹根際分離獲得可促進(jìn)白菜、花生生長(zhǎng)的5 株細(xì)菌菌株。本文擬利用7 株細(xì)菌菌株對(duì)煙草種子進(jìn)行浸種處理，篩選可促進(jìn)種子萌發(fā)的菌株，并進(jìn)一步研究其促生特性，為獲得高質(zhì)量無病煙苗提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試種子 供試煙草種子為烤煙主栽品種K326。

1.1.2 供試菌株 7 株細(xì)菌菌株均為本實(shí)驗(yàn)室分離，包括Bacillus toyonensisAMM-2，Bacillus mobilisAMM-5，放射性土壤桿菌（Agrobacterium radiobacter）KKS-6-N1，貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）HP9，堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌（Bacillus firmus）HP10，貪銅菌屬（Cupriavidussp.）WP9，惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）HGD3。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基、NBRIP 培養(yǎng)基、MKB培養(yǎng)基及CAS 檢測(cè)平板。

1.2 方法

1.2.1 煙草種子萌發(fā)試驗(yàn) 將7 株菌株活化、轉(zhuǎn)接入LB 液體培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)24 h，調(diào)節(jié)菌懸液OD600值至0.5（活菌數(shù)約108cfu/mL）備用。選擇大小一致均勻飽滿的煙草種子，經(jīng)0.2% CuSO4溶液消毒15 min，去離子水沖洗，于不同菌株的菌懸液中浸泡2 h，無菌濾紙吸干后，置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿放置20 粒種子，每菌株設(shè)3 個(gè)重復(fù)，以LB 培養(yǎng)基為對(duì)照。光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d[8]，補(bǔ)充無菌水保持濾紙濕潤(rùn)。每天統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽粒數(shù)，計(jì)算發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)；于14 d 時(shí)測(cè)定每個(gè)發(fā)芽幼苗的苗長(zhǎng)并計(jì)算活力指數(shù)[9]。

1.2.2 菌株溶磷能力測(cè)定 挑取各菌株的單菌落點(diǎn)種于NBRIP 培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d，觀察是否有溶磷圈。將具溶磷能力的菌株轉(zhuǎn)接至NBRIP 液體培養(yǎng)基中，搖床振蕩培養(yǎng)7 d，以不接菌培養(yǎng)基為對(duì)照，每處理重復(fù)3 次。培養(yǎng)液經(jīng)4000 r/min 離心25 min、取適量上清液以鉬藍(lán)比色法測(cè)定可溶磷含量，溶磷量為培養(yǎng)7 d 與1 d 可溶性磷含量之差[10]。

1.2.3 菌株產(chǎn)IAA 能力測(cè)定 將活化菌株接種于含L-色氨酸（100 mg/L）的LB 培養(yǎng)基中、振蕩培養(yǎng)24 h 后，取100 μL 培養(yǎng)液加入等體積Salkowski比色液、避光30 min 進(jìn)行定性分析，顏色變紅者為陽性。定量測(cè)定時(shí)，取離心的24 h 菌株培養(yǎng)液上清，按上述方法反應(yīng)并測(cè)定OD530值，根據(jù)IAA 標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算培養(yǎng)液的IAA 含量，每菌株3 個(gè)重復(fù)[11]。

1.2.4 菌株分泌鐵載體能力測(cè)定 取10 μL 菌懸液滴加至平鋪于CAS 平板的滅菌濾紙上、28 ℃培養(yǎng)48 h 進(jìn)行定性分析，能分泌鐵載體的菌落周圍出現(xiàn)橙黃色透明圈[12]。定量測(cè)定時(shí)，挑取菌落接種于MKB 培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)48 h 后，離心收集上清，與CAS 檢測(cè)液等體積混勻后靜置1 h，測(cè)定630 nm 處的吸光值（As），以超純水為對(duì)照；MKB培養(yǎng)基相應(yīng)反應(yīng)的OD630值為參比值（Ar），鐵載體分泌活性=[(Ar-As)/Ar]×100%[13]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

以SPSS 20.0 軟件分析數(shù)據(jù)，使用Duncan 法進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同細(xì)菌菌株浸種對(duì)煙草種子萌發(fā)的影響

表1 結(jié)果顯示，煙草種子發(fā)芽勢(shì)顯著高于對(duì)照的是AMM-2 和AMM-5 處理，顯著降低的為WP9和HGD3 處理；且AMM-2 及AMM-5 發(fā)芽率較對(duì)照分別提高10.41%和12.50%。發(fā)芽指數(shù)表征發(fā)芽速率和種子活力，活力指數(shù)是種子發(fā)芽速率和生長(zhǎng)量的綜合反映，可更好地反映種子活力。就這兩個(gè)指數(shù)而言，HGD3 菌株處理最低，而AMM-2 和AMM-5 菌株處理則顯著高于對(duì)照，芽長(zhǎng)較對(duì)照分別增長(zhǎng)11.99%和12.50%。可見AMM-2 和AMM-5可以明顯促進(jìn)煙草種子萌發(fā)。

2.2 兩株氨化芽孢桿菌菌株浸種對(duì)煙草種子發(fā)芽動(dòng)態(tài)及幼苗形態(tài)的影響

對(duì)AMM-2 和AMM-5 菌株浸種處理的煙草種子發(fā)芽數(shù)進(jìn)行動(dòng)態(tài)追蹤（圖1），發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和浸種處理組均在第4 天開始萌發(fā)，之后菌株浸種顯著加快了種子的萌發(fā)速度，發(fā)芽數(shù)急劇上升，于處理后7 d達(dá)到最大萌發(fā)數(shù)；而對(duì)照組至10 d達(dá)到最大值，且發(fā)芽數(shù)遠(yuǎn)低于2 株菌株的處理組。萌發(fā)前期AMM-5 浸種的煙草發(fā)芽數(shù)略高于AMM-2，6 d 后已基本無差別。萌發(fā)14 d 時(shí)，2 個(gè)菌株處理組的幼苗較對(duì)照發(fā)育更為均勻一致（圖2）。

表1 不同細(xì)菌菌株對(duì)煙草種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)的影響Table 1 Effects of different strains on germination related indexes of tobacco seeds

圖1 兩株氨化芽孢桿菌菌株浸種的煙草種子發(fā)芽數(shù)變化Fig.1 Dynamic variation of germinated seed numbers of tobacco soaking with two ammonifying Bacillus strains

圖2 兩株氨化芽孢桿菌菌株浸種14 d 時(shí)的煙草幼苗形態(tài)Fig.2 Seedling morphology of tobacco soaked with two ammonifying Bacillus strains for 14 days

2.3 兩株氨化芽孢桿菌菌株促生特性的分析

結(jié)果顯示，AMM-2 和AMM-5 菌株均可在含Ca3(PO4)2的NBRIP 平板上生長(zhǎng)，且在菌落周圍有明顯的溶磷水解圈，表明菌株具有溶磷能力（圖3A）；在CAS 平板上，與不產(chǎn)鐵載體的大腸桿菌菌株相比，2 個(gè)菌株均可分泌鐵載體，尤以AMM-2 菌株更為明顯（圖3B，3C）。定量測(cè)定結(jié)果表明（表2），2 個(gè)菌株的溶磷水平相當(dāng)，在分泌IAA 及產(chǎn)生鐵載體的能力上存在差別，AMM-2 菌株產(chǎn)生更高的IAA和鐵載體。

圖3 兩株氨化芽孢桿菌菌株的溶磷及鐵載體定性分析Fig.3 Quality analysis on phosphorus solubilization and siderophore of two ammonifying Bacillus strains

表2 不同細(xì)菌菌株的促生特性Table 2 Growth-promoting characteristics of different strains

3 討 論

本研究利用7 株不同種屬的細(xì)菌菌株進(jìn)行種子萌發(fā)試驗(yàn)，包括4 株芽孢桿菌屬菌株（HP9、HP10、AMM-2 和AMM-5）、1 株貪銅菌屬菌株（WP9）、1株假單胞菌屬菌株（HGD3）及1 株土壤桿菌屬菌株（KKS-6-N1）。這7 株菌株除AMM-2 和AMM-5分離自煙區(qū)土壤，對(duì)其是否具促生特性未知外；其余5 株菌均分離自茶樹根際，前期研究已經(jīng)表明KKS-6-N1 具有固氮及分泌鐵載體的特性，對(duì)白菜、空心菜及莧菜有促生效應(yīng)[14]；具溶磷能力的HP9和HP10 可以顯著促進(jìn)花生幼苗的生長(zhǎng)[15]。本試驗(yàn)中5 株具有促生特性的菌株對(duì)煙草種子萌發(fā)的影響不一，HGD3 抑制了種子的發(fā)芽、WP9 浸種的種子發(fā)芽勢(shì)也顯著低于對(duì)照，其余菌株的處理則與對(duì)照并無顯著差異；明顯促進(jìn)煙草種子萌發(fā)的菌株仍是來源于煙區(qū)土壤的AMM-2 和AMM-5 菌株。相似的報(bào)道在大豆內(nèi)生芽孢桿菌菌株、苧麻根圍的伯克霍爾德氏菌菌株，及青稞根際分離菌株對(duì)來源植物的促種子萌發(fā)試驗(yàn)中被證實(shí)[16-18]。這些結(jié)果均表明本土土著微生物具有更好的促生作用，而其他環(huán)境來源的菌株由于其生態(tài)適應(yīng)性不同[19]，對(duì)煙草的促生效果不同。

對(duì)煙草的促生研究大多利用盆栽試驗(yàn)。從貴州煙草根際分離的7 株產(chǎn)植物激素菌株對(duì)煙草有促生效果，其中3 株為芽孢桿菌屬[20]。從煙草根際篩選的解鉀PGPR 菌株也可顯著促進(jìn)幼苗的根系發(fā)育[2]。彎曲芽孢桿菌菌株提高了盆栽土壤的有效磷鉀含量，促進(jìn)了煙草生長(zhǎng)[1]。而對(duì)于煙草種子萌發(fā)的影響研究則較少。席淑雅等[21]將烤煙根際分離的溶磷菌株加入育苗基質(zhì)中用于烤煙漂浮育苗，發(fā)芽率較對(duì)照提高1.8%、煙苗生長(zhǎng)指標(biāo)高于對(duì)照。吳翔等[8]從四川煙區(qū)根際篩選到產(chǎn)IAA、鐵載體和HCN 能力的促生菌，由Bacillus tequilensis，Enterobacter xiangfangensis，Klebsiella variicola以及腸桿菌科等4 株菌株構(gòu)建的促生菌系可顯著提高煙草種子的發(fā)芽率。本研究中，來自貴州煙區(qū)土壤的2 株芽孢桿菌菌株的浸種處理可顯著提高種子的發(fā)芽勢(shì)，較未接種對(duì)照提前3 d 達(dá)到最大萌發(fā)數(shù)，且14 d 時(shí)的幼苗表現(xiàn)更為均一，可明顯減輕煙草萌發(fā)時(shí)參差不齊的狀況，具有應(yīng)用于漂浮育苗的潛力。而且，由于2 株菌株具有較強(qiáng)的分解有機(jī)氮能力及優(yōu)良的促生特性，可考慮菌劑與有機(jī)肥復(fù)配，不僅可提高有機(jī)肥的氮素有效性，對(duì)于促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)也有潛在的應(yīng)用前景。

此外，研究表明可產(chǎn)生IAA 的菌株通過與植物的互作，能顯著促進(jìn)植株的生長(zhǎng)[22]。從不同環(huán)境及植物根際分離的菌株產(chǎn)IAA 能力存在差異。據(jù)報(bào)道從棉花根際分離的8 株固氮菌，其IAA 產(chǎn)量為6.62～22.83 μg/mL[23]；從水稻中分離的55 株菌產(chǎn)IAA 的能力介于1～10 μg/mL[24]；而花生根際的10株固氮菌可分泌1.36～17.80 μg/mL 的IAA[25]。本研究獲得的2 株氨化細(xì)菌菌株均可分泌IAA，其中AMM-2 菌株可產(chǎn)生21.57 μg/mL 的IAA，是一株產(chǎn)IAA 較高的菌株，其對(duì)煙草幼苗的生長(zhǎng)及根系發(fā)育的影響有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

利用5 株分離自茶樹根際的PGPR 菌株、2 株分離自貴州煙區(qū)土壤的高效氨化細(xì)菌菌株浸種進(jìn)行煙草種子萌發(fā)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)來自煙區(qū)土壤的芽孢桿菌菌株Bacillus toyonensisAMM-2 和B.mobilisAMM-5 具有顯著的促萌發(fā)作用，發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)均顯著高于未浸種處理，且在處理后7 d 即達(dá)到最大發(fā)芽數(shù)，較對(duì)照提前了3 d。促生試驗(yàn)表明，AMM-2 和AMM-5 菌株具有溶磷、分泌IAA 及鐵載體的能力，是2 株具有優(yōu)良促生特性的高效氨化芽孢桿菌菌株，且AMM-2 具有更高的產(chǎn)IAA 和鐵載體能力。