層出鐮孢菌連續(xù)移植菌株生物學(xué)特性及遺傳多樣性研究

暢引東，譚再鈞，董海龍，任文勇，李新鳳，王建明*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,山西 太谷 030801;2.吉林省延邊州和龍市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,吉林 和龍 133500)

層出鐮孢菌(Fusariumproliferatum)是一種重要的植物病原真菌,可侵染玉米引起莖基腐、穗腐和鞘腐等多種病害[1]。真菌由于個(gè)體小、繁殖快等原因,極容易發(fā)生遺傳變異[2]。這使得原先致病力極強(qiáng)的野生真菌菌株在實(shí)驗(yàn)室條件下擴(kuò)繁多次后,往往會(huì)出現(xiàn)致病力減弱或完全喪失的退化現(xiàn)象。真菌致病力喪失問題給試驗(yàn)研究的正常開展造成了許多不利的影響。因此,明確連續(xù)移植對(duì)菌株遺傳變異的影響對(duì)今后如何避免此類問題有積極的指導(dǎo)意義。

真菌的遺傳變異與其特有的生殖方式有關(guān)。真菌可通過無性繁殖進(jìn)行大量的擴(kuò)繁,而有性生殖或某些真菌特有的準(zhǔn)性生殖賦予其對(duì)環(huán)境強(qiáng)大的適應(yīng)能力[3]。長期以來正是這種能力使其在生長環(huán)境改變、病毒侵染等外界因素影響下基因發(fā)生了重組或抑制了某些基因的表達(dá),使細(xì)胞內(nèi)酶合成能力下降,導(dǎo)致菌株退化變異[1～4]。目前,對(duì)植物病原真菌在實(shí)驗(yàn)室條件下菌株退化方面的研究較少,多數(shù)研究是針對(duì)用于生防的蟲生真菌和大型食用真菌的菌種退化問題。而這些研究大多是針對(duì)繼代培養(yǎng)或連續(xù)移植對(duì)菌株的生長性狀及致病力變化的影響等,并沒有對(duì)菌株生長性狀或致病力發(fā)生改變的原因做出進(jìn)一步解釋[4-8]。

有關(guān)真菌生物學(xué)特性和致病性的變異研究,大多集中在菌株因長期環(huán)境條件改變對(duì)其表型變化的影響方面,但有關(guān)其與相關(guān)分子水平上的相互聯(lián)系的研究報(bào)道較少。有研究表明尖孢鐮孢菌西瓜?；途杲?jīng)連續(xù)移植多次后出現(xiàn)的菌落角變與DNA甲基化有關(guān)[9]。菌株的退化變異是否與其遺傳分化有關(guān),尚未有報(bào)道。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于真菌的遺傳分化研究,其反映出的遺傳多態(tài)性與菌株致病力分化、培養(yǎng)性狀等有一定的相關(guān)性[10,11]。因此,本試驗(yàn)研究了層出鐮孢菌連續(xù)移植菌株的生物學(xué)特性與ISSR遺傳多樣性變化的相互關(guān)系，以期闡釋連續(xù)移植對(duì)該菌株的影響,為進(jìn)一步揭示鐮孢菌的致病分子機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株為從玉米莖基腐病嚴(yán)重發(fā)生的罹病植株上分離鑒定的層出鐮孢菌致病菌株[12,13]。

1.2 菌株連續(xù)移植

對(duì)采用稀釋法獲得的單孢分離菌株進(jìn)行移植。每間隔4 d挑取菌落邊緣菌絲移植,置于人工氣候箱中25 ℃恒溫培養(yǎng),共移植20代次,獲得的菌株生長4 d后儲(chǔ)存于4 ℃菌種保藏箱[12]。

1.3 連續(xù)移植菌株生物學(xué)特性的研究

1.3.1 連續(xù)移植菌株菌落形態(tài)的觀測 選取第1、5、10、15、20次移植的層出鐮孢菌菌株,轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基。每個(gè)菌株設(shè)3次重復(fù),置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。在接種后的第2～7天以十字劃線法測量PDA培養(yǎng)基上菌落直徑,測算菌株的菌絲生長速率,并使用SPSS軟件進(jìn)行不同次移植菌株間菌絲生長速率的差異顯著性分析[12]。選取第1、10、20次移植的菌株,在培養(yǎng)4 d、7 d、30 d后,分別對(duì)其菌落形態(tài)進(jìn)行記錄并拍照。

1.3.2 連續(xù)移植菌株顯微形態(tài)的觀察 選取第1、10、20次移植的菌株,分別在培養(yǎng)4 d、7 d和30 d后,在顯微鏡下觀察菌株小型分生孢子、大型分生孢子、厚垣孢子、產(chǎn)孢梗和分生孢子座的數(shù)量、大小和形狀等,記錄并拍照[13]。

1.3.3 連續(xù)移植菌株產(chǎn)孢量的測定 選取第1、10、20次移植的菌株,轉(zhuǎn)接于綠豆湯培養(yǎng)液中,放置于搖床中培養(yǎng)4 d,溫度設(shè)置為25 ℃,轉(zhuǎn)速設(shè)置為150 r/min。在第5天,用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行孢子量的測定,每個(gè)菌株測定3次,取平均值，并使用SPSS軟件進(jìn)行不同次移植菌株間孢子量的差異顯著性分析。

1.4 連續(xù)移植菌株致病力的測定

選用經(jīng)前期試驗(yàn)鑒定的玉米感病品種為寄主,將其種子浸入含2%有效氯的次氯酸鈉消毒液中,在搖床中以150 r/min振蕩消毒15 min,用無菌水清洗3～5次后,再在55 ℃無菌水中浸種10 h。然后將玉米種子置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行催芽。待玉米種子長出約1.5 cm根或0.5 cm芽后進(jìn)行菌株接種。

選取發(fā)芽一致的玉米種子，分別浸入層出鐮孢菌第1、10和20次移植菌株的106個(gè)/mL孢子懸浮液中,15 min后將其播種于裝有無菌土的塑料箱(長35 cm,寬25 cm,深15 cm)中,每箱播種15粒種子,覆蓋無菌土厚度2～3 cm,以無菌水浸種為空白對(duì)照[14]。將培養(yǎng)塑料箱放入光照恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),白天溫度設(shè)為25 ℃,光照12 h,光照強(qiáng)度為12000 lx;夜間溫度設(shè)為15 ℃,時(shí)長為6 h。在播種30 d后,按照玉米莖基腐病病情指數(shù)進(jìn)行病情調(diào)查[15]。

1.5 連續(xù)移植菌株遺傳多樣性的研究

選取層出鐮孢菌第1～5、第8～12和第16～20次移植的菌株,采用改良的CTAB法[16]進(jìn)行基因組DNA的提取。選用何婧等[17]篩選的3個(gè)ISSR引物812、831和888,并參考其PCR擴(kuò)增程序及PCR反應(yīng)體系,分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測,并用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照記錄。將PCR擴(kuò)增的DNA條帶轉(zhuǎn)換成二進(jìn)制數(shù)據(jù),有帶的記為1,無帶的記為0,統(tǒng)計(jì)成0/1矩陣。利用NTSYSpc (Version 2.10e)軟件進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)聚類圖[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 連續(xù)移植菌株的生物學(xué)特性

2.1.1 連續(xù)移植菌株的菌落形態(tài) 層出鐮孢菌第1、10、20次移植菌株在PDA培養(yǎng)基中生長4 d、7 d和30 d后的菌落形態(tài)見圖1。從圖1中可以看出,層出鐮孢菌第1代菌株與第10代、第20代菌株在菌落形態(tài)和菌落顏色上無明顯差異,最初幾天菌落顏色為白色,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長會(huì)在菌落中心產(chǎn)生淡紫色菌絲;該菌株第1代與第10代、第20代菌株在基物顏色上略有差異,第1代菌株的基物顏色隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而逐漸變深,在第30天時(shí)產(chǎn)生深藍(lán)色菌核,而第10代和第20代菌株在各培養(yǎng)時(shí)期的基物顏色相對(duì)于第1代菌株而言較淡,未形成深藍(lán)色菌核。

圖1 層出鐮孢菌連續(xù)移植菌株的菌落形態(tài)

層出鐮孢菌連續(xù)移植菌株在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d時(shí)的菌落直徑及菌絲生長速率見表1。從表1可知,層出鐮孢菌連續(xù)移植菌株的菌落直徑和菌絲生長速率隨移植次數(shù)的增加呈下降趨勢。

表1 層出鐮孢菌的菌落直徑及菌絲生長速率

2.1.2 連續(xù)移植菌株的顯微形態(tài) 層出鐮孢菌不同次移植菌株的顯微形態(tài)觀察結(jié)果如表2和圖2所示。結(jié)果表明：層出鐮孢菌第1、10、20次移植菌株在分生孢子和產(chǎn)孢梗的數(shù)量和顯微形態(tài)等方面沒有明顯的差異。層出鐮孢菌不同次移植菌株在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d后,未能發(fā)現(xiàn)大孢子、產(chǎn)孢梗和厚垣孢子；在培養(yǎng)7 d后的部分菌株中發(fā)現(xiàn)了大小孢子及厚垣孢子；在培養(yǎng)30 d后可大量發(fā)現(xiàn)大小孢子、產(chǎn)孢梗、厚垣孢子,分生孢子座也有發(fā)現(xiàn)(表2)。從圖2中可以看出,層出鐮孢菌不同次移植菌株的大小分生孢子、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、厚垣孢子及分生孢子座的形態(tài)、大小等未見明顯差異。

a:小孢子；b:大孢子；c:分生孢子座和大孢子；d:產(chǎn)孢梗；e:假頭狀；1、10、20指移植次數(shù)。圖2 層出鐮孢菌不同代連續(xù)移植菌株的顯微形態(tài)

表2 層出鐮孢菌不同代連續(xù)移植菌株在不同培養(yǎng)時(shí)期的顯微形態(tài)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.1.3 連續(xù)移植菌株的產(chǎn)孢量 層出鐮孢菌不同次移植菌株在綠豆湯培養(yǎng)液中培養(yǎng)4 d后的孢子產(chǎn)量詳見表3。從表3中可知,層出鐮孢菌連續(xù)移植菌株的產(chǎn)孢量隨著移植次數(shù)的增加呈明顯的下降趨勢,由第1代的322400000個(gè)/mL下降到第20代的198400000個(gè)/mL。

表3 層出鐮孢菌不同代連續(xù)移植菌株的產(chǎn)孢量

2.2 連續(xù)移植菌株的致病力

連續(xù)移植層出鐮孢菌菌株對(duì)玉米幼苗的致病力結(jié)果詳見表4和圖3。從表4可以看出,經(jīng)連續(xù)移植的菌株雖然均能導(dǎo)致玉米苗期發(fā)病,但不同次移植菌株對(duì)幼苗的致病力呈遞減趨勢,其中第1次移植層出鐮孢菌的致病力最強(qiáng),接菌后幼苗的病情指數(shù)達(dá)41.0；第20次移植菌株接菌后幼苗的病情指數(shù)只有36.6。從圖3玉米幼苗的長勢可見：接種層出鐮孢菌的玉米幼苗在長勢和出苗率上略低于空白對(duì)照CK,發(fā)病較輕；接種第1代層出鐮孢菌的玉米幼苗相對(duì)于接種其它代菌株的幼苗而言較稀疏和矮小。

表4 不同代連續(xù)移植菌株的致病力

圖3 連續(xù)移植菌株處理后玉米幼苗的長勢

2.3 連續(xù)移植菌株的遺傳多樣性

選取的15個(gè)層出鐮孢菌不同次移植菌株的遺傳相似性系數(shù)和聚類圖分別見圖4和表5。從圖4可以看出,在層出鐮孢菌連續(xù)移植菌株間基因組DNA在簡單重復(fù)序列間區(qū)的遺傳分化明顯,菌株間存在豐富的遺傳多樣性。但是結(jié)合表5和圖4,分別從第1～5、8～12和16～20次連續(xù)移植菌株來看,可發(fā)現(xiàn)移植次數(shù)相鄰菌株間的遺傳距離相近，例如：表5中4代次菌株與5代次間、10代次與11代次間、16代次與17代次間的遺傳相似性系數(shù)在各自菌株范圍內(nèi)較高,分別為1、1和0.93。從圖4中也可觀察到部分移植次數(shù)相鄰菌株被劃歸為一個(gè)類群,例如,2代次與3代次、4代次與5代次、10代次與11代次、11代次與12代次、16代次與17代次菌株。由此可知不同菌株在遺傳分化時(shí)移植次數(shù)相近菌株間的遺傳分化力度較小。在遺傳分化過程中,除少數(shù)菌株如1代次和9代次菌株外,大多數(shù)移植次數(shù)相差大的菌株間遺傳相似性系數(shù)較低(表5)。

表5 層出鐮孢菌繼代培養(yǎng)菌株不同代次間的遺傳相似性系數(shù)

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)對(duì)層出鐮孢菌不同移植次數(shù)菌株的菌落形態(tài)、顯微形態(tài)和致病性等生物學(xué)特性，以及ISSR遺傳多樣性等方面進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：經(jīng)連續(xù)移植的層出鐮孢菌菌株的菌落形態(tài)無明顯差異,培養(yǎng)基基物顏色隨著移植次數(shù)增多而逐漸變淡,菌株的產(chǎn)孢量、致病力和菌絲生長速率隨著培養(yǎng)次數(shù)增多而下降;層出鐮孢菌不同次移植菌株間遺傳分化明顯,但在移植次數(shù)相近菌株間的遺傳分化力度較??；但是ISSR分子標(biāo)記所反映出的菌株間遺傳分化與菌株間表現(xiàn)出的生物學(xué)特性無明顯的相關(guān)性。綜合來看,隨著連續(xù)移植次數(shù)的增加，層出鐮孢菌的擴(kuò)繁力和致病力均下降,出現(xiàn)了明顯的退化現(xiàn)象。

對(duì)菌株菌落形態(tài)、顯微形態(tài)和產(chǎn)孢量的測定可以從宏觀上明確菌株的生長情況,從而進(jìn)一步了解不同代次菌株間的生長變異情況。對(duì)菌株致病力的測定可以從另一個(gè)方面反映出菌株的生物學(xué)性狀。劉海英等對(duì)玉米大斑病菌繼代培養(yǎng)菌株的研究表明，隨著轉(zhuǎn)接次數(shù)的增加,菌株的菌絲生長速度、產(chǎn)孢量、分生孢子大小及致病性均呈顯著下降趨勢[5]。諸多研究發(fā)現(xiàn),許多經(jīng)連續(xù)移植或繼代培養(yǎng)菌株的產(chǎn)孢量均會(huì)出現(xiàn)明顯的下降趨勢[5,8,19,20]。菌株的這些生物學(xué)性狀是由基因調(diào)控的。那些在形態(tài)和致病性上有差異的菌株間,其差異是否由基因上的差異造成的？這需要從分子生物學(xué)的角度做多層次的研究。本試驗(yàn)采用ISSR遺傳多樣性研究方法探索了層出鐮孢菌菌株退化的原因,結(jié)果表明該病原菌不同次移植菌株間具有明顯的遺傳分化,但是基于ISSR-PCR結(jié)果所反映出的菌株間遺傳分化與本試驗(yàn)中所測定的菌株生物學(xué)指標(biāo)無明顯的相關(guān)性,無法據(jù)此對(duì)菌株各生物學(xué)指標(biāo)差異與特定基因的關(guān)聯(lián)性做進(jìn)一步的研究。秦敏等通過RAPD分子標(biāo)記對(duì)不同致病力稻瘟病菌繼代培養(yǎng)菌株的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)強(qiáng)致病菌繼代培養(yǎng)菌株的致病性變異大,其DNA的遺傳變異也較大,而弱致病菌繼代培養(yǎng)菌株的致病性和DNA遺傳變異均較小[6]。有些研究表明基于ISSR分子標(biāo)記的鐮孢菌遺傳分化與菌株致病性有一定的相關(guān)性[10,21～23],但在本研究中未能反映出這種相關(guān)性,我們?cè)趯?duì)連續(xù)移植禾谷鐮孢菌進(jìn)行ISSR遺傳多樣性研究時(shí)也得到了相似的結(jié)果[14]。研究人員對(duì)在棉花和水瓊脂培養(yǎng)基中連續(xù)移植的尖孢鐮孢菌萎蔫?；偷闹虏×瓦z傳分化進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)AFLP分子標(biāo)記所反映出的遺傳分化與菌株致病力的增加無明顯的相關(guān)性[24]。一般來說,病原真菌在經(jīng)歷有性生殖或準(zhǔn)性生殖之后,其遺傳特性會(huì)因生長環(huán)境變化而產(chǎn)生變異,而真菌的無性生殖是為了在短期內(nèi)大量擴(kuò)繁,其遺傳變異較少。由此可見經(jīng)過連續(xù)移植的菌株僅僅是發(fā)生退化,其產(chǎn)生變異的可能性較低,而與菌株退化相關(guān)的DNA遺傳差異還有待于進(jìn)一步的研究。