聲觸診組織成像定量技術(shù)診斷大鼠急性肝衰竭及評(píng)估預(yù)防性用藥效果的價(jià)值

杜 洋 土繼政 韓 梅 郝 磊 郭西源 梁 華 王興華

急性肝衰竭是由多種病因引起的一種急性肝臟損害，進(jìn)展快、死亡率高，既往無肝硬化病史，其病理表現(xiàn)為肝細(xì)胞水腫、壞死和炎細(xì)胞浸潤(rùn)等急性肝壞死征象，及早發(fā)現(xiàn)、診斷和治療可以明顯改善預(yù)后［1］。目前急性肝衰竭的臨床診斷主要依據(jù)其臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查，早期影像學(xué)缺乏特征性表現(xiàn)，因此探索早期無創(chuàng)性評(píng)估急性肝衰竭及其預(yù)后的檢查方法是亟待解決的問題。剪切波彈性成像已逐漸成為診斷肝衰竭的重要手段［2-3］。其中聲觸診組織成像定量（virtual touch tissue imaging quantification，VTIQ）技術(shù)可以定性和定量檢測(cè)組織的硬度，具有較好的重復(fù)性［4］?；诖?，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用VTIQ技術(shù)檢測(cè)大鼠肝臟剪切波速度（shear wave velocity，SWV），旨在探討該技術(shù)在預(yù)測(cè)急性肝衰竭及評(píng)估預(yù)防性用藥效果中的價(jià)值。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量220～250 g，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

二、實(shí)驗(yàn)材料和儀器

硫代乙酰胺（TAA，上海凜恩科技發(fā)展有限公司），枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊（美常安，北京韓美藥品有限公司），水合氯醛（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、白蛋白及血氨檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）。西門子Acuson Oxana 2彩色多普勒超聲診斷儀，9L4線陣探頭，頻率9 MHz；配備VTIQ技術(shù)。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.動(dòng)物分組及急性肝衰竭模型制備［5］：將24只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型未治療組及模型治療組，每組8只。模型治療組予以美常安（100 mg·kg-1·d-1）稀釋后灌胃治療，對(duì)照組和模型未治療組每天注射等量生理鹽水，共注射8 d。模型未治療組和模型治療組均于實(shí)驗(yàn)第6、7天分別通過腹腔注射TAA（200 mg·kg-1·d-1）制備急性肝衰竭模型，共注射2次。

2.超聲檢查：分別于造模前后測(cè)量各組大鼠肝臟SWV。10%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔麻醉，將大鼠前胸及腹壁備皮，仰臥位固定。應(yīng)用常規(guī)超聲掃查肝臟回聲、血流等，維持探頭與掃查部位垂直和固定，避開肝內(nèi)管道結(jié)構(gòu)，選擇VTIQ模式，調(diào)節(jié)感興趣區(qū)大小為1.5 mm×1.5 mm，取肝臟同一部位距體表深度0.9 cm處，測(cè)量同一深度不同位置肝臟組織的SWV，共測(cè)量8次，記錄最大值（SWVmax）、最小值（SWVmin）和平均值（SWVmean）。

3.血清學(xué)檢測(cè)：麻醉大鼠后，經(jīng)腹主動(dòng)脈無菌取血進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)包括血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、白蛋白及血氨。

4.病理學(xué)檢查：取血后處死所有大鼠，取肝臟同一部位大小為1 cm×1 cm×1 cm組織（取材部位盡量與感興趣區(qū)取樣部位一致），10%甲醛固定，蠟塊包埋，連續(xù)切片，HE染色。根據(jù)病變程度分別描述為肝細(xì)胞水腫（+）、氣球樣變（++）、點(diǎn)狀壞死伴門管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（+++）及小灶樣壞死（++++）［6］。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、造模結(jié)果及血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)第8天，除模型未治療組1只大鼠因藥物注射過量和（或）個(gè)體耐藥性差死亡，余均造模成功。各組大鼠血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果見表1；各組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、白蛋白及血氨比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。

表1 各組大鼠血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果比較（）

表1 各組大鼠血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果比較（）

與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型未治療組比較，bP<0.05

組別對(duì)照組（8）模型未治療組（7）模型治療組（8）F值P值血氨（mmol/L）34.18±11.93 109.27±8.42a 61.67±4.83ab 84.481<0.01谷丙轉(zhuǎn)氨酶（U/L）56.99±8.44 135.66±13.74a 121.09±12.16ab 61.254<0.01總膽紅素（μmol/L）6.13±1.65 15.14±3.28a 11.04±1.31ab 10.515<0.01白蛋白（g/L）34.52±1.80 29.98±0.99a 30.88±1.34a 11.929<0.01

二、大鼠肝臟組織病理檢測(cè)結(jié)果

對(duì)照組表現(xiàn)為正常肝組織，光鏡下肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索呈放射狀排列在中央靜脈周圍；模型未治療組表現(xiàn)為肝組織肉眼下普遍腫大，光鏡下肝小葉結(jié)構(gòu)顯示不清，肝細(xì)胞水腫、變性，以中央靜脈為中心的肝細(xì)胞壞死，呈點(diǎn)狀、橋接壞死，部分可見灶狀壞死，門管區(qū)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肝竇受壓變窄或消失，肝中央靜脈淤血。模型治療組表現(xiàn)為肝細(xì)胞脂肪變性及氣球樣變，炎癥壞死較模型未治療組減輕，肝竇擴(kuò)張，部分可見點(diǎn)狀壞死，灶狀壞死不明顯，肝中央靜脈淤血。三組均未見明顯的肝纖維化。見表2和圖1A、圖2A、圖3A。

三、各組大鼠肝臟SWV比較

造模前對(duì)照組、模型未治療組和模型治療組SWVmean 分別為（2.43±0.57）m/s、（2.61±0.42）m/s和（2.71±0.49）m/s，各組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模后對(duì)照組、模型未治療組和模型治療組SWVmean分別為（2.50±0.71）m/s、（3.56±0.48）m/s和（3.06±0.27）m/s，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.747，P<0.05）。見圖1B、圖2B、圖3B。

表2 各組大鼠肝臟組織病理檢測(cè)結(jié)果比較 只

四、ROC曲線分析

調(diào)整造模前SWV水平后，造模后模型未治療組和模型治療組SWV不同（F=5.623，P<0.05）；模型未治療組造模后SWV值較模型治療組高0.474 m/s（95%可信區(qū) 間 ：0.038～0.909 m/s，P<0.05）。 模 型 未 治 療 組SWVmax、SWVmin和SWVmean所構(gòu)建的ROC曲線顯示，以SWVmean預(yù)測(cè)急性肝衰竭的曲線下面積最大，為0.938，當(dāng)截?cái)嘀禐?.83 m/s，其診斷大鼠急性肝衰竭的敏感性和特異性分別為100%和75.00%。見表3和圖4。

表3 模型未治療組大鼠肝臟SWV值預(yù)測(cè)急性肝衰竭的ROC曲線分析

討 論

急性肝衰竭作為臨床常見的嚴(yán)重肝病癥候群，主要表現(xiàn)為嚴(yán)重的原發(fā)性肝損傷，進(jìn)展快，死亡率高［1，7］，其病理表現(xiàn)主要為肝臟炎癥壞死。本實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射TAA制備急性肝衰竭大鼠模型，大鼠的血清學(xué)結(jié)果及病理結(jié)果均提示造模成功。有研究［8］表明盡早發(fā)現(xiàn)及對(duì)癥治療對(duì)急性肝衰竭的預(yù)后和提高生存率有重要意義。肝損傷患者腸道屏障受損，導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)及腸屏障功能紊亂；革蘭陰性桿菌過度生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生大量腸源性內(nèi)毒素，進(jìn)一步損傷肝臟。美常安作為微生態(tài)制劑，其成分為屎腸球菌和枯草桿菌，可利用和吸收腸道內(nèi)的含氮有害物質(zhì)，抑制產(chǎn)胺和內(nèi)毒素生成，降低腸道pH值，從而降低血氨，所以使用美常安對(duì)急性肝衰竭患者進(jìn)行預(yù)防性治療，對(duì)改善急性肝衰竭預(yù)后及提高生存率有重要意義，但目前缺乏評(píng)價(jià)其療效的方法。剪切波彈性成像作為一種無創(chuàng)性檢查技術(shù)，已被歐洲超聲醫(yī)學(xué)與生物學(xué)聯(lián)合會(huì)《肝臟超聲彈性成像臨床應(yīng)用指南與建議（2017）》、世界超聲醫(yī)學(xué)與生物學(xué)聯(lián)合會(huì)等國(guó)內(nèi)外指南及共識(shí)［3，9］推薦為診斷肝臟疾病的重要方法，主要應(yīng)用于肝臟纖維化分期及肝硬化，相比剪切波彈性成像在肝纖維化及肝硬化中的廣泛應(yīng)用，其在肝衰竭中的應(yīng)用相對(duì)較少［10］。肝臟的硬度測(cè)值與炎癥和（或）壞死程度密切相關(guān)，炎癥和（或）壞死越嚴(yán)重所測(cè)彈性值越高，其SWV也越快。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)急性肝衰竭大鼠模型預(yù)防性注射美常安，并應(yīng)用VTIQ對(duì)大鼠肝臟SWV進(jìn)行測(cè)量，旨在探討VTIQ在預(yù)測(cè)急性肝衰竭及評(píng)估預(yù)防性用藥效果中的應(yīng)用價(jià)值。

Kuroda等［11］根據(jù)肝臟病變程度及是否具有肝性腦病將患者分為急性肝炎組、重型肝炎組和暴發(fā)性肝炎組，應(yīng)用聲輻射力脈沖成像（acoustic radiation force impulse，ARFI）測(cè)量各組入院時(shí)SWVmean，結(jié)果表明，ARFI測(cè)量的SWV可反映肝臟損傷的程度，其數(shù)值的連續(xù)變化可評(píng)估急性肝衰竭患者的預(yù)后，可作為早期預(yù)測(cè)暴發(fā)性肝炎的指標(biāo)之一。本課題小組在前期實(shí)驗(yàn)［12］中也發(fā)現(xiàn)炎癥壞死可影響肝纖維化指數(shù)評(píng)價(jià)肝纖維化分期的準(zhǔn)確性，其原因?yàn)檠装Y壞死影響肝臟組織硬度，導(dǎo)致肝臟SWV的增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型未治療組SWVmean較對(duì)照組升高（P<0.05），其預(yù)測(cè)急性肝衰竭的截?cái)嘀禐?.83 m/s，ROC曲線下面積、敏感性和特異性分別為0.938、100%和75.00%，說明SWV值在急性肝衰竭早期檢測(cè)中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)還應(yīng)用SWV對(duì)急性肝衰竭大鼠預(yù)防性用藥的效果進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果顯示，造模后模型治療組SWVmean較模型未治療組降低，但較造模前升高，病理檢查也提示肝組織炎癥壞死也較模型未治療組減輕；SWVmean較對(duì)照組增高，肝細(xì)胞水腫、變性，細(xì)胞核被壓縮，細(xì)胞密度減低，可見少量炎癥反應(yīng)。表明SWV在急性肝衰竭預(yù)防性治療的評(píng)估中具有一定應(yīng)用價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)中，急性肝衰竭肝臟硬度增加的原因可能與肝細(xì)胞水腫、變性及炎癥壞死有關(guān)。有研究［13-14］表明，炎癥程度、血流灌注壓力、脂肪浸潤(rùn)程度及細(xì)胞密度均會(huì)影響肝臟硬度。本實(shí)驗(yàn)中影響模型未治療組大鼠肝臟SWV最主要的因素可能是炎癥壞死。然而，本實(shí)驗(yàn)僅關(guān)注了炎癥壞死對(duì)SWV的影響，并未考慮血流灌注壓力、脂肪浸潤(rùn)程度及細(xì)胞密度等影響因素，有待今后進(jìn)一步研究。

綜上所述，VTIQ技術(shù)對(duì)預(yù)測(cè)大鼠急性肝衰竭及評(píng)估預(yù)防性用藥效果方面具有一定應(yīng)用價(jià)值。