養(yǎng)心定悸膠囊預(yù)處理對(duì)缺血再灌注大鼠心肌梗死面積的影響

程浩 汪雁博 郝國(guó)貞 姜云發(fā) 支偉 王慶

急性心肌梗死的病理生理學(xué)機(jī)制是冠狀動(dòng)脈血供急劇減少或中斷導(dǎo)致的心肌壞死[1]。再灌注治療是急性心肌梗死的核心治療，其目標(biāo)是恢復(fù)冠脈血流，保證心肌灌注，縮小梗死面積，改善患者預(yù)后。近年來(lái)，人們?cè)谂R床中嘗試采用多種再灌注治療方式，以期改善梗死區(qū)域心肌灌注水平，減少心肌梗死面積，然而其治療策略仍有待進(jìn)一步探索和優(yōu)化[2]。養(yǎng)心定悸膠囊的處方來(lái)源于《傷寒論》中的經(jīng)典名方炙甘草湯，主要組方包括炙甘草、桂枝、地黃、麥冬、紅參、芝麻、生姜、大棗、阿膠九味藥材，具有益氣養(yǎng)血，滋陰復(fù)脈之功效，在治療“心動(dòng)悸、脈結(jié)代”方面具有良好的效果[3]。既往研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)心定悸膠囊的主要成分如炙甘草、桂枝、麥冬等均具有抗血栓、抗炎和抗心律失常等心臟保護(hù)作用，可有效降低缺血心肌細(xì)胞的炎性反應(yīng)水平，進(jìn)而減少心肌缺血再灌注損傷[4]。養(yǎng)心定悸膠囊也已在臨床中用于急性心肌梗死并發(fā)心律失常的防治。本研究觀(guān)察養(yǎng)心定悸膠囊預(yù)處理對(duì)缺血再灌注大鼠心肌梗死面積的影響，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 本研究使用由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供的健康雄性SD大鼠[許可證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001]30只作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，6～8周齡，體重250～300 g，溫度(22±1)℃，濕度45%～55%，自由進(jìn)食飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后建立模型。

1.2 藥品和儀器 (1) 藥品：使用養(yǎng)心定悸膠囊(石藥集團(tuán)河北永豐藥業(yè)有限公司，0.5 g/粒)配置溶液，灌胃使用。(2)主要儀器：超純水系統(tǒng)(星號(hào)：NW10LVF，香港Heal Force)、-70℃超低溫冰箱(型號(hào)：DW HL-668，安徽中科美菱)、微量移液器(型號(hào)：Proline，蘇州BIOHIT)、酶標(biāo)儀(型號(hào)：ELX-800，美國(guó)BIOTEK)、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(型號(hào)：Proline，蘇州BIOHIT)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(型號(hào)：HH-4 金壇，榮華儀器)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)：DH36001B，天津天津泰斯特)。(3) 主要試劑：0.9%氯化鈉溶液(中國(guó)都邦藥業(yè))、PBS(貨號(hào)：P10033，中國(guó)雙螺旋)、TTC(貨號(hào)：T109275，中國(guó)阿拉丁)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào)：WLA004，中國(guó)萬(wàn)類(lèi)生物)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)測(cè)試盒(貨號(hào)：E006，中國(guó)南京建成)。

1.3 動(dòng)物模型制備 將大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、模型組和養(yǎng)心定悸組，每組10只。(1) 假手術(shù)組：大鼠縫線(xiàn)不結(jié)扎，其他操作與模型組相同。(2)模型組：將大鼠給予同養(yǎng)心定悸組相同體積的0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行灌胃處理，3次/d，連續(xù)7 d，手術(shù)操作同養(yǎng)心定悸組。(3)養(yǎng)心定悸組：將大鼠用0.1 mg/g的養(yǎng)心定悸溶液(石藥集團(tuán)河北永豐藥業(yè)有限公司，0.5 g/粒)進(jìn)行灌胃給藥；3次/d，連續(xù)7 d。隨后腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠，將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)上，仰臥位。頸部去毛消毒，剪開(kāi)皮膚暴露氣管，連接至呼吸機(jī)行機(jī)械通氣，設(shè)置呼吸頻率80次/min，潮氣量6～8 ml/kg，呼吸比為2∶1，根據(jù)具體呼吸頻率及深度適當(dāng)調(diào)整呼吸參數(shù)。左前胸去毛消毒，順肋間隙方向，胸骨左側(cè)切開(kāi)皮膚約1～1.5 cm，分離皮下組織和肌肉，入胸后推開(kāi)胸腺，暴露心臟及大血管根部。剪開(kāi)心包，在左心耳下緣與肺動(dòng)脈間可見(jiàn)左冠狀動(dòng)脈前降支起始部，在距離主動(dòng)脈根部約3～5 mm 處，以左冠狀靜脈為標(biāo)志，用尼龍縫線(xiàn)結(jié)扎造成缺血，縫合皮膚，計(jì)時(shí)器計(jì)時(shí)45 min。打開(kāi)尼龍縫線(xiàn)，使血液流通，復(fù)灌3 h。模型建立3 h后，同步處死各只大鼠，收集心肌組織及頸靜脈血(分離血清)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 病理組織學(xué)觀(guān)察 模型建立3 h后，從右頸動(dòng)脈注入1% Evans blue 3 ml/kg，區(qū)分缺血區(qū)和非缺血區(qū)心肌。隨即取下整個(gè)心臟，以磷酸緩沖液(PBS,pH值7.4)沖洗，剪去心房，心室部分垂直于長(zhǎng)軸橫切成4～6塊1～2 mm厚的心肌片，置于1%氯化三苯基四氮唑 (2,3,5-Tripheny-ltetrazoliumchloride,TTC)溶液，37℃孵育12 min，將活的心肌組織染成磚紅色。經(jīng) TTC染色的心肌厚片固定于10%緩沖中性甲醛溶液24 h。每片心臟用濾紙吸干后稱(chēng)重。雙面彩色掃描，圖像輸入電腦保存。掃描后的心肌片保存在甲醛濾液內(nèi)，隨后石蠟包埋。非缺血區(qū)已由苔酚藍(lán)染成藍(lán)色，缺血危險(xiǎn)區(qū)內(nèi)包括磚紅色的存活心肌及未被染色的灰白梗死組織。根據(jù)心肌厚片表面的三種顏色，用電腦圖像分析軟件(Photoshop 7.0和計(jì)算不規(guī)則多邊形面積軟件 2.0.4)分別測(cè)定雙面梗死區(qū)面積和缺血區(qū)面積占整片心肌切面的百分比。

1.5 心肌損傷標(biāo)志物測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取心肌組織重量，按重量(g)∶體積(ml)=1∶9的比例加入9倍的0.9%氯化鈉溶液，冰浴條件下機(jī)械勻漿，2 500 r/min，離心10 min，制備成10%的勻漿上清液。將心肌組織勻漿上清，BCA法進(jìn)行肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脫氫酶(LDH)蛋白含量測(cè)定。每個(gè)治療組的心臟組織勻漿后，根據(jù)制造商的說(shuō)明(Life Span Bio Sciences,Inc.,Seattle,WA,USA)通過(guò)ELISA測(cè)量腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，白介素-6(IL-6)，丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的濃度。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠心肌梗死面積比較 3組大鼠周齡及體重比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具備可比性。3組大鼠依照分組進(jìn)行處理后，迅速取下心臟，進(jìn)行TTC染色后，大鼠梗死區(qū)心肌呈現(xiàn)白色，非梗死曲為暗紅色，對(duì)比較明顯。假手術(shù)各組心肌均呈現(xiàn)暗紅色，無(wú)白色梗死區(qū)域出現(xiàn)。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌梗死面積顯著增加[(36.59±10.17)%]，而給予養(yǎng)心定悸溶液預(yù)處理的大鼠，心肌梗死面積較模型組顯著減小[(23.42±8.26)%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0052)。見(jiàn)圖1，表1。

圖1 3組心肌梗死面積比較

2.2 3組心肌損傷標(biāo)志物比較 與假手術(shù)組比較，模型組和養(yǎng)心定悸組大鼠血清CK-MB、LDH均顯著增高(P<0.01)，提示缺血/再灌注損傷導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜損傷，導(dǎo)致心肌壞死標(biāo)志物漏出。預(yù)防性應(yīng)用養(yǎng)心定悸溶液后，養(yǎng)心定悸組大鼠CK-MB較模型組顯著降低(P<0.01)。養(yǎng)心定悸組大鼠LDH與模型組比較顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠心肌梗死面積和心肌損傷標(biāo)志物水平變化

2.3 3組炎性反應(yīng)標(biāo)志物水平的變化 與假手術(shù)組相比，養(yǎng)心定悸組和模型組的TNF-α、IL-6和MDA含量均升高(P<0.01)，而養(yǎng)心定悸組的TNF-α水平低于模型組(P<0.05)。模型組和養(yǎng)心定悸組的SOD水平較低(P<0.01)，養(yǎng)心定悸組平高于模型組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 3組炎性反應(yīng)標(biāo)志物水平的變化

3 討論

缺血再灌注損傷是臨床治療急性心肌梗死面臨的重要問(wèn)題和挑戰(zhàn)，對(duì)于患者心肌梗死面積和預(yù)后將產(chǎn)生深刻影響。既往多項(xiàng)研究表明，多種因素參與了缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展的重要病理生理學(xué)機(jī)制，例如氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)和心肌細(xì)胞凋亡等等。目前，許多專(zhuān)家在藥物和非藥物預(yù)防心肌缺血再灌注損傷方面進(jìn)行了深入探索[5,6],但是筆者發(fā)現(xiàn)針對(duì)急性心肌梗死再灌注治療后心肌保護(hù)的有效措施尚無(wú)定論。本研究采用經(jīng)典的結(jié)扎前降支的方法制備大鼠心肌梗死模型[7,8]，制作時(shí)將結(jié)扎部位選擇在左心耳下緣與肺動(dòng)脈間可見(jiàn)左冠狀動(dòng)脈前降支起始部，該方法操作簡(jiǎn)單、成功率高且與臨床AMI 癥狀接近，成模率和存活率高，為研究的順利進(jìn)行提供了保障。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)心定悸膠囊預(yù)處理可能具有減少缺血再灌注損傷大鼠心肌梗死面積的作用，這一作用可能與其抑制再灌注過(guò)程中的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

當(dāng)心肌持續(xù)缺血時(shí)，多種炎癥細(xì)胞激活，釋放炎性因子，引起心肌炎癥損傷，從而進(jìn)一步加重心肌缺血和缺血再灌注損傷。心肌缺血產(chǎn)生大量的氧自由基，這些氧自由基作用于細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸，并形成氧自由基脂質(zhì)過(guò)氧化MDA的最終產(chǎn)物[9]。 因此，MDA的水平可以反映心肌損傷的程度。SOD是心肌中重要的抗氧化酶，可以清除氧自由基并抵消MDA的損害，具有減輕缺血/再灌注損傷的作用[10,11]。本研究中，與模型組相比，養(yǎng)心定悸組大鼠MDA水平減低，SOD水平升高。提示養(yǎng)心定悸膠囊可能通過(guò)清除氧自由基減輕氧自由基對(duì)再灌注損傷的影響，進(jìn)而減少心肌梗死面積。TNF-α和IL-6與心肌缺血-再灌注損傷密切相關(guān)[12]。心肌細(xì)胞在缺血再灌注過(guò)程中可合成和分泌大量的TNF-α，后者是心肌缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵介質(zhì)，可通過(guò)不同途徑導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷、溶解、甚至死亡[13]。IL-6在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中處于關(guān)鍵位置，在心肌缺血-再灌注損傷中也起到了重要作用[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)養(yǎng)心定悸膠囊預(yù)處理可能是通過(guò)降低TNF-α 和IL-6 水平的機(jī)制來(lái)減輕缺血心肌的炎癥反應(yīng)，從而減輕了心肌缺血再灌注損傷的程度。

冠心病屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”、“心痹”范疇，發(fā)生機(jī)制為氣滯血瘀、心脈痹阻。先前的基礎(chǔ)和臨床研究表明，冠心病心絞痛患者具有典型的血瘀證表現(xiàn)，治療方法以宣痹通陽(yáng)和補(bǔ)益氣陰為主。既往研究證實(shí)，臨床應(yīng)用炙甘草湯治療不穩(wěn)定型心絞痛具有良好的效果，能夠明顯改善心絞痛患者的臨床癥狀。養(yǎng)心定悸膠囊收載于《中國(guó)藥典》2015版和《新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)》中，由炙甘草、桂枝、地黃、麥冬、紅參、芝麻、生姜、大棗、阿膠共計(jì)九味中藥材組成，具有益氣養(yǎng)血，滋陰復(fù)脈之功效，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各種疾病導(dǎo)致的心律失常的治療，可以顯著改善患者的臨床癥狀，具有良好的臨床療效[15]。本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用養(yǎng)心定悸膠囊預(yù)處理可以使心肌梗死大鼠的梗死面積減小，因此具有一定程度的心肌保護(hù)作用。

養(yǎng)心定悸膠囊組方中桂枝味辛溫，善溫經(jīng)、通脈、通陽(yáng)化氣；甘草味甘平，能益氣復(fù)脈，兩者配伍，為臨床“辛甘化陽(yáng)”的經(jīng)典藥對(duì)。其組方中的甘草中甘草酸類(lèi)成分甘草酸和黃酮類(lèi)成分甘草苷具有抗血栓、抗炎、抗心律失常、心肌細(xì)胞保護(hù)作用，可有效改善心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減輕心肌缺血再灌注損傷的程度[16,17]。桂枝中的主要活性成分桂皮酸和桂皮醛具有降壓、抗炎、抗血小板聚集和抗凝血等多種藥理作用[18]，因此我們可以推測(cè)甘草酸、桂皮酸和桂皮醛等可能均參與了心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。其他成分如大棗、麥冬、紅參和生姜也具有一定程度的抗氧化作用[19,20]。本研究中，經(jīng)過(guò)養(yǎng)心定悸膠囊預(yù)處理對(duì)心肌梗死大鼠的心肌保護(hù)作用可能與養(yǎng)心定悸膠囊上述綜合的藥理作用有關(guān)，但具體作用機(jī)制仍需要深入探討。

總之，養(yǎng)心定悸膠囊制備的溶液預(yù)處理對(duì)急性心肌梗死大鼠具有一定的心肌保護(hù)作用，該作用可能與養(yǎng)心定悸膠囊預(yù)處理減少缺血再灌注損傷大鼠心肌梗死面積，抑制心肌梗死后炎性反應(yīng)有關(guān)。但由于樣本量較少，觀(guān)察指標(biāo)僅限于炎癥反應(yīng)方面，而未行養(yǎng)心定悸膠囊對(duì)心肌細(xì)胞凋亡及其他可能的機(jī)制更為全面深入的研究，也未對(duì)養(yǎng)心定悸膠囊心機(jī)保護(hù)作用的核心組成成分進(jìn)行分析，因此有待于更多的觀(guān)察和分析。