鹵蟲作為生物餌料傳播蝦類病原風(fēng)險的研究進(jìn)展

王一婷，史成銀，隋麗英，葉仕根，董 宣，黃 倢

（1.大連海洋大學(xué)，遼寧大連 116023；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室，青島市海水養(yǎng)殖流行病學(xué)與生物安保重點實驗室，山東青島 266071；3.天津科技大學(xué)，天津 300457）

鹵蟲（Artemia）也稱豐年蝦或豐年蟲（brine shrimp），是一種典型的無選擇性濾食小型甲殼類動物，屬于節(jié)肢動物門（Arthropoda）、甲殼動物亞門（Crustacea）、鰓足綱（Branchiopoda）、無甲目（Anostraca）、鹵蟲科（Artemiidae）、鹵蟲屬（Artemia）[1]，廣泛分布于沿海日曬鹽場和內(nèi)陸鹽湖等高鹽水體中[2]。鹵蟲具有營養(yǎng)價值高、休眠卵易保存、孵化操作簡單等優(yōu)點，被廣泛用于水產(chǎn)育苗尤其是蝦類育苗，是蝦類繁育的重要生物餌料[3-4]。我國是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，2018 年海水養(yǎng)殖蝦產(chǎn)量達(dá)140.91 萬t[5]。我國對鹵蟲卵需求量居于世界首位，占全球總需求量的50%左右。目前市場上流通的鹵蟲卵大部分來自中國、美國、俄羅斯、中亞國家的內(nèi)陸鹽湖，少部分來源于沿海日曬鹽場和人工養(yǎng)殖區(qū)域[6-7]。

原良種場是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的基礎(chǔ)，其苗種質(zhì)量至關(guān)重要，是保障水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的根本[8-9]。鹵蟲是蝦蟹類育苗環(huán)節(jié)的關(guān)鍵生物餌料，其是否攜帶蝦類致病病原已受到多方關(guān)注，但暫未有關(guān)于鹵蟲可被蝦類病毒感染的報道。本文系統(tǒng)梳理了鹵蟲作為生物餌料傳播蝦類病原的研究進(jìn)展，以期為正確使用鹵蟲等生物餌料提供技術(shù)支持。

1 鹵蟲的人工感染試驗方法

關(guān)于鹵蟲傳播蝦類病原的相關(guān)研究大多數(shù)采用人工感染方式，包括浸泡法和摻病毒飼喂法（viral feeding mixture）[10-11]，具體見表1。摻病毒飼喂法是將病毒粗提液與鹵蟲食物混合，使病毒吸附在鹵蟲食物表面，當(dāng)鹵蟲攝食帶有病毒粘附的食物時，病毒會隨著食物進(jìn)入到鹵蟲體內(nèi)并富集，從而使鹵蟲攜帶病毒[10-17]。

鹵蟲一般以浮游藻類、酵母、豆粉、米糠等為食。根據(jù)食物種類不同，摻病毒飼喂法暫分為兩類：一類是以浮游植物作為食物與病毒粗提液混合，即病毒-浮游植物吸附法（virus-phytoplankton adhesion）[12]；另一類將米糠與病毒粗提液混合，即病毒-米糠吸附法（virus-rice bran adhesion）。目前尚無報道哪一種感染方式更適合研究鹵蟲作為蝦類病原的媒介生物，但不同感染方式在感染效果上的確存在差異。此外，不同病毒檢測手段也會產(chǎn)生不同的感染效果評價。

2 鹵蟲可能是某些蝦類病毒的傳播載體

鹵蟲是否能感染蝦類病毒受到了較多關(guān)注，不少研究者開展了蝦類病毒對鹵蟲的感染及鹵蟲傳播蝦類病毒的風(fēng)險研究，通過PCR 等高靈敏的檢測技術(shù)，使人們認(rèn)識到鹵蟲存在傳播蝦類病毒的風(fēng)險。但多數(shù)研究由于缺少組織病理學(xué)、原位雜交、電鏡細(xì)胞病理學(xué)的直接證據(jù)，尚未能證實鹵蟲能被這些蝦類病毒感染。然而，鹵蟲作為載體傳播蝦類病原的風(fēng)險不容忽視。

2.1 白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）

張家松等[13-14]采用病毒-浮游植物吸附法和浸泡法，對4 種不同發(fā)育階段（無節(jié)幼體、后無節(jié)幼體、擬成蟲、成蟲）的鹵蟲進(jìn)行攻毒試驗。攻毒感染時長為5 d，攻毒2 次/d，第6～7 天投喂相同密度的湛江等鞭金藻（Isochrysiszhanjiangensis）；經(jīng)饑餓24 h 后選取10～50 尾不同發(fā)育時期的鹵蟲進(jìn)行PCR 檢測。浸泡組采用相同濃度的病毒粗提液進(jìn)行浸泡，感染2 次/d，3 h/次，之后用消毒海水沖洗，其余處理方法同病毒-浮游植物吸附組。套式PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，對照組和浸泡組鹵蟲皆呈WSSV 陰性，而病毒-浮游植物吸附組不同發(fā)育階段鹵蟲皆為WSSV 陽性。用病毒-浮游植物吸附法處理后的鹵蟲投喂凡納對蝦（Penaeus vannamei）仔蝦，經(jīng)套式PCR 檢測顯示對蝦皆為WSSV 陽性；但采用VP28 特異性囊膜蛋白的反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測，顯示不同發(fā)育階段鹵蟲皆為WSSV 陰性。同時，用對照組、浸泡組和病毒浮游-植物吸附組的鹵蟲投喂凡納對蝦仔蝦，發(fā)現(xiàn)死亡率差異不顯著。該研究表明：通過病毒-浮游植物吸附法可以使鹵蟲攜帶WSSV，但對VP28-mRNA 進(jìn)行RT-PCR 檢測，未檢測到WSSV在鹵蟲體內(nèi)復(fù)制，因此推測鹵蟲是WSSV 的機械攜帶者。

2.2 傳染性肌壞死病毒（infectious myonecrosis virus，IMNV）

Da Silva 等[15]采用病毒-浮游植物吸附法和浸泡法對鹵蟲成蟲進(jìn)行IMNV 感染試驗，經(jīng)RTPCR 檢測，顯示兩種感染途徑下的鹵蟲皆為陽性，但鹵蟲并沒有明顯的發(fā)病跡象。用上述兩種途徑感染后的鹵蟲投喂凡納對蝦幼蝦，顯示幼蝦的IMNV陽性率不同，病毒-浮游植物吸附組陽性率大于40%，而浸泡組陽性率僅為10%。后經(jīng)熒光定量PCR 檢測，兩種感染途徑下的幼蝦病毒載量差異不顯著，因此推測鹵蟲能作為IMNV 的傳播載體。雖然在攻毒15 d 內(nèi)并沒有發(fā)生幼蝦大量死亡，但鹵蟲作為IMNV 的傳播載體不應(yīng)該被忽視。

2.3 肝胰腺細(xì)小病毒（hepatopancreatic parvovirus，HPV）

Sivakumar 等[11]采用病毒-米糠吸附法和浸泡法，對不同發(fā)育階段（無節(jié)幼體、后無節(jié)幼體、幼蟲、擬成蟲、成蟲）的鹵蟲進(jìn)行攻毒試驗，收集攻毒后的鹵蟲用于感染斑節(jié)對蝦（P.monodon）仔蝦。對病毒-米糠混合和浸泡感染組不同階段的鹵蟲進(jìn)行PCR 檢測，結(jié)果除無節(jié)幼體外，其余4 個階段鹵蟲檢測結(jié)果皆為陽性，但未發(fā)現(xiàn)鹵蟲死亡。將感染后的鹵蟲投喂斑節(jié)對蝦仔蝦，兩種感染途徑下鹵蟲均可使斑節(jié)對蝦仔蝦出現(xiàn)死亡，但對照組未發(fā)生死亡，表明鹵蟲可能是HPV 的傳播載體。

2.4 羅氏沼蝦野田村病毒（Macrobrachium rosenbergii nodavirus，MrNV）和極小病毒（extra small virus，XSV）

Sudhakaran 等[16]采用病毒-米糠混合法和浸泡法，對不同發(fā)育階段（無節(jié)幼體、后無節(jié)幼體、幼蟲、擬成蟲、成蟲）的鹵蟲進(jìn)行MrNV和XSV 感染試驗，將攻毒后鹵蟲投喂羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）仔蝦。結(jié)果顯示：用病毒-米糠吸附法和浸泡法感染后，5 種不同發(fā)育階段的鹵蟲套式RT-PCR 檢測結(jié)果皆為陽性，但兩種感染組鹵蟲死亡率與對照組差異不顯著。用攻毒后的鹵蟲直接投喂羅氏沼蝦仔蝦，顯示兩種感染組仔蝦分別在攻毒后第8 天和第9 天全部死亡，并出現(xiàn)典型白尾病（white tail disease，WTD）癥狀，發(fā)病蝦中MrNV 和XSV 套式RT-PCR 檢測結(jié)果也為陽性。對照組仔蝦未出現(xiàn)死亡，且MrNV 和XSV 套式RT-PCR 檢測結(jié)果均為陰性。因此判斷鹵蟲可能成為MrNV 和XSV 的傳播載體，可以增加幼蝦患白尾病的風(fēng)險。

2.5 斑節(jié)對蝦桿狀病毒（Penaeus monodon baculovirus，MBV）

Sarathi 等[17]采用病毒-米糠吸附法和浸泡法，對不同發(fā)育階段（無節(jié)幼體、后無節(jié)幼體、幼蟲、擬成蟲、成蟲）的鹵蟲進(jìn)行MBV 感染試驗，并將攻毒后的鹵蟲投喂斑節(jié)對蝦仔蝦。結(jié)果顯示：病毒-米糠吸附法和浸泡法感染后，5 個發(fā)育階段的鹵蟲經(jīng)套式PCR 檢測皆為陰性[17]，將感染后的鹵蟲無節(jié)幼體投喂斑節(jié)對蝦仔蝦，發(fā)現(xiàn)兩組斑節(jié)對蝦仔蝦在感染后15 d 內(nèi)未出現(xiàn)死亡，且經(jīng)套式PCR檢測皆為MBV 陰性；然而同批感染試驗中，投喂MBV 病料的斑節(jié)對蝦仔蝦在感染15 d 后死亡率達(dá)到了80.1%。所以，關(guān)于鹵蟲是否能成為MBV 的傳播載體需進(jìn)一步研究。

3 鹵蟲可感染多種致病弧菌

Defoirdt 等[18]研究表明，鹵蟲可以被多種水產(chǎn)致病弧菌感染，如哈維氏弧菌（V.harveyi）、鰻弧菌（V.anguillarum）、坎貝氏弧菌（V.campbellii）和副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）。有文獻(xiàn)[19]報道：隨著鹵蟲卵孵化，弧菌會大量繁殖，在鹵蟲卵孵化前，部分測試弧菌可通過胚胎外膜屏障進(jìn)入并定植于鹵蟲胚胎內(nèi)，可導(dǎo)致孵化鹵蟲產(chǎn)量減少10%。海洋弧菌是危害海水養(yǎng)殖生物的重要致病病原，不僅對鹵蟲生長發(fā)育產(chǎn)生影響，也嚴(yán)重危害了蝦類養(yǎng)殖業(yè)?；【蓪?dǎo)致對蝦患病，如哈維氏弧菌通過幼蝦體表的傷口以及消化道侵染幼蝦，使幼蝦患病甚至死亡[20]。鰻弧菌質(zhì)?？蓴y帶許多毒力因子，如細(xì)菌鞭毛蛋白、胞外蛋白酶、細(xì)胞外溶血素等，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖對蝦健康[21-22]。副溶血弧菌是危害水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要病原之一[23-24]，尤其是帶有pVA1 型質(zhì)粒的副溶血弧菌可以使對蝦患急性肝胰腺壞死?。ˋHPND）而出現(xiàn)急性死亡，死亡率高達(dá)100%[24-26]。雖然目前未有鹵蟲能夠在自然環(huán)境下感染攜帶pVA1 型質(zhì)粒的副溶血弧菌的報道，但帶有pVA1 型質(zhì)粒的副溶血弧菌可在試驗條件下感染鹵蟲無節(jié)幼體，且影響鹵蟲存活率[25]。對副溶血弧菌毒力蛋白PirABVP進(jìn)行純化后感染鹵蟲無節(jié)幼體，在感染0、12、36、48 和60 h 后進(jìn)行免疫組化分析和電鏡觀察，顯示鹵蟲中腸和后腸的上皮細(xì)胞受到破壞，導(dǎo)致核固縮、細(xì)胞空泡化，線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生不同程度損傷[26]。加之，鹵蟲易感的坎貝氏弧菌也可以攜帶pVA1 型質(zhì)粒[24]，提示鹵蟲可能存在傳播AHPND 致病菌的風(fēng)險。

4 警惕鹵蟲傳播蝦肝腸孢蟲（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）的風(fēng)險

已有報道[27]稱，可在鹵蟲中檢測到EHP。另外Karthikeyan 等[28]采用浸泡法對鹵蟲無節(jié)幼體進(jìn)行攻毒試驗，待鹵蟲無節(jié)幼體發(fā)育到后無節(jié)幼體、幼體、擬成蟲幼體、成蟲不同階段后進(jìn)行PCR 檢測，顯示5 個不同發(fā)育階段鹵蟲EHP 檢測均為陽性；對鹵蟲成蟲進(jìn)行組織切片，觀察到鹵蟲成蟲體內(nèi)有孢子樣包涵體，但是鹵蟲并沒有明顯的發(fā)病跡象；將陽性鹵蟲無節(jié)幼體投喂給凡納對蝦仔蝦后，經(jīng)PCR 檢測凡納仔蝦EHP 結(jié)果也為陽性，這提示應(yīng)重視鹵蟲攜帶并傳播EHP 的風(fēng)險。本研究團(tuán)隊最近對鹵蟲進(jìn)行了EHP 感染試驗，并用原位環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（ISDL）進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，EHP陽性信號只出現(xiàn)在感染3 d 后的鹵蟲組織中，感染7 d 后陽性信號消失；用卡爾科夫羅爾試劑對鹵蟲進(jìn)行染色，可觀察到大量孢子樣熒光，但EHP 的PCR 檢測為陰性，說明Karthikeyan 等觀察到的可能不是EHP 的孢子。

5 防控建議

5.1 系統(tǒng)開展鹵蟲的病原學(xué)和流行病學(xué)研究

目前關(guān)于鹵蟲是否可以傳播蝦類病原的相關(guān)試驗，多數(shù)是通過人工感染的方法來探究，大部分研究未經(jīng)過電鏡、免疫組化、原位雜交等方法確認(rèn)鹵蟲是否為蝦類病原的宿主或媒介。而且據(jù)李富文[29]報道，鹵蟲還可以攜帶聚縮蟲、假單胞菌、腸桿菌、沙門氏菌等病原。2019 年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部等十部委聯(lián)合下發(fā)的《關(guān)于加快推進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)綠色發(fā)展的若干意見》明確指出“加強疫病防控，落實全國動植物保護(hù)能力提升工程，健全水生動物疫病防控體系，加強監(jiān)測預(yù)警和風(fēng)險評估，強化水生動物疫病凈化和突發(fā)疫情處置，提高重大疫病防控和應(yīng)急處置能力”。鹵蟲等作為水產(chǎn)養(yǎng)殖尤其是蝦類育苗的關(guān)鍵生物餌料，其病原學(xué)和流行病學(xué)目前在我國并未引起足夠重視，建議加強支持開展鹵蟲的病原學(xué)和流行病學(xué)研究，加強進(jìn)口鹵蟲的檢驗檢疫，系統(tǒng)分析鹵蟲病原在我國蝦類養(yǎng)殖、苗種產(chǎn)業(yè)和野生生物中的流行病學(xué)特征及其風(fēng)險，掌握其致病性、傳播模式等病原學(xué)特征基礎(chǔ)信息，研發(fā)病原檢測技術(shù)，為開展病害檢測、監(jiān)測和有效防控提供基礎(chǔ)理論支撐。

5.2 規(guī)范鹵蟲卵生產(chǎn)管理和孵化操作

建立鹵蟲卵采購、儲存、加工和孵化的標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范。該規(guī)范應(yīng)該包括風(fēng)險病原檢疫、隔離、孵化率評估和孵化鹵蟲幼體質(zhì)量評價。在鹵蟲卵孵化過程中伴隨著細(xì)菌的大量繁殖，為避免將細(xì)菌帶入養(yǎng)殖水體中，在鹵蟲卵孵化前應(yīng)對孵化海水和設(shè)施工具進(jìn)行消毒。建議將孵化過程分解為蟲卵脫殼、孵化、收集和后處理4 個過程。脫殼過程中，可邊攪拌邊加入一定劑量的次氯酸鈉（NaClO），至肉眼觀察殼已脫凈且卵呈現(xiàn)棕紅色時，應(yīng)立即停止脫殼。收集脫殼卵并用海水充分沖洗，進(jìn)一步浸入硫代硫酸鈉溶液中漂洗，取出后再次沖洗，置于孵化裝置中。孵化溫度宜控制在28～30 ℃，收集孵化后的鹵蟲，再次消毒后分裝，有條件的可進(jìn)行速凍，以最大限度降低鹵蟲攜帶活菌的風(fēng)險。但此過程僅對細(xì)菌效果明顯，對于病毒性病原，可嘗試采取輻照等方式降低傳播風(fēng)險。

5.3 探索鹵蟲生物安保產(chǎn)業(yè)發(fā)展途徑

目前，無特定病原（specific pathogen free，SPF）技術(shù)在畜牧和水產(chǎn)育種中已得到廣泛應(yīng)用。也正是由于建立了SPF 培育技術(shù)，使得凡納對蝦由美洲的區(qū)域性品種變?yōu)槿蛐责B(yǎng)殖且產(chǎn)量最大的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種[8]。由于鹵蟲卵來源于鹽湖和日曬鹽場，要做到SPF 鹵蟲卵規(guī)模化生產(chǎn)有較大難度，建議探索實施鹵蟲生物安保產(chǎn)業(yè)發(fā)展途徑，包括但不限于以下幾個方面的技術(shù)方案：（1）按使用目的評估鹵蟲產(chǎn)區(qū)的生物風(fēng)險，例如有蝦類致病風(fēng)險的鹵蟲源不供給到蝦類育苗場，或者供給到低生物安保要求的蝦類育苗場；（2）構(gòu)建鹵蟲卵采收加工鏈的風(fēng)險管理和生物安保體系；（3）建立鹵蟲病原高通量鑒定和檢測技術(shù)；（4）研發(fā)鹵蟲病原凈化技術(shù)；（5）研究無特定病原鹵蟲的整個生態(tài)替代方案；（6）探索和評估發(fā)展工廠化高密度人工鹵蟲培養(yǎng)技術(shù)的可行性。

5.4 探索替代產(chǎn)品

鹵蟲和橈足類都是水產(chǎn)育苗過程中的常用生物餌料。據(jù)報道橈足類也可檢出WSSV[30]。隨著高通量測序和生物信息學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的海洋脊椎和無脊椎動物新病毒被發(fā)現(xiàn)[31-32]，而鹵蟲、橈足類、蝦類同屬于甲殼動物，仍然存在傳播蝦類病原的風(fēng)險。建議開發(fā)水產(chǎn)養(yǎng)殖鮮活餌料的替代產(chǎn)品，如合成飼料、微囊餌料等。另外，近年來有團(tuán)隊嘗試使用搖蚊幼蟲等昆蟲幼蟲作為水產(chǎn)育苗的生物餌料，昆蟲幼蟲蛋白含量高，人工養(yǎng)殖體系相對成熟，更為重要的是昆蟲幼蟲的生長過程可遠(yuǎn)離水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)域，并且與甲殼動物的親緣關(guān)系更遠(yuǎn)，可大大減少傳播蝦類病原的風(fēng)險。

6 小結(jié)

鹵蟲可能攜帶WSSV、IMNV、HPV、MrNV和XSV 等蝦類病毒，還能被多種致病弧菌感染，也可能攜帶并傳播EHP。因此，鹵蟲具有傳播蝦類致病病原的風(fēng)險，應(yīng)深入開展鹵蟲作為生物餌料傳播蝦類病原的相關(guān)研究，不斷研發(fā)和完善病原檢測技術(shù)，以便為水產(chǎn)養(yǎng)殖綠色發(fā)展和生物安保體系建設(shè)提供參考。