2016—2019 年我國(guó)I 類新城疫病原學(xué)監(jiān)測(cè)與遺傳進(jìn)化分析

（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）正禽腮腺炎病毒屬（Orthoavulavirus），為單股負(fù)鏈RNA 病毒，可感染240 多種禽類。NDV 只有1 個(gè)血清型，但可分為多種基因型。根據(jù)病毒F基因序列差異，毒株可分為I 類（class I）和II 類（class II）兩大類。II 類NDV 流行時(shí)間較長(zhǎng)，至少包括21 種基因型。歷史上引起5 次ND 大流行的毒株和常用疫苗株均屬于II 類NDV[1]。I 類NDV 只有1 個(gè)基因型，但可細(xì)分為3 個(gè)基因亞型[1]。2003 年I 類NDV 在法國(guó)野生麻鴨中被首次分離到，此后又出現(xiàn)于野生水禽和野鳥(niǎo)中，近年來(lái)又傳播至家禽[2-4]。2008 年通過(guò)病毒分離，我國(guó)首次證實(shí)I 類NDV 的存在，隨后研究發(fā)現(xiàn)病毒已在我國(guó)廣泛流行[5-6]。回顧性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2002 年在浙江、福建等地活禽市場(chǎng)檢出的病毒與其同類，說(shuō)明I 類NDV 早已存在[7]。雖然I 類NDV 絕大多數(shù)為無(wú)毒株或弱毒株，但已有學(xué)者證實(shí)NDV 弱毒株可通過(guò)雞或雞胚連續(xù)傳代增強(qiáng)毒力[8-11]。我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)發(fā)達(dá)，I 類NDV 污染面廣[12]且存在基因變異和毒力增強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)。因此，對(duì)國(guó)內(nèi)家禽中攜帶的I 類NDV 進(jìn)行長(zhǎng)期系統(tǒng)監(jiān)測(cè)，掌握病毒分布和流行規(guī)律，對(duì)新城疫防控具有重要意義。本研究于2016—2019 年，按照《國(guó)家動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃》，在我國(guó)23 個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）998 個(gè)采樣點(diǎn)，隨機(jī)采集家禽口咽/泄殖腔雙拭子樣本、野鳥(niǎo)糞便樣本和環(huán)境樣本，通過(guò)病毒分離和常規(guī)RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)I 類NDV，并對(duì)分離株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，以期為科學(xué)防控新城疫提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本與雞胚

從國(guó)內(nèi)23 個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）的批發(fā)市場(chǎng)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、養(yǎng)殖場(chǎng)和屠宰場(chǎng)，隨機(jī)采集不同種類家禽的口咽/泄殖腔雙拭子樣品和環(huán)境樣品，并在野鳥(niǎo)棲息地采集野鳥(niǎo)糞便樣品。SPF 雞胚，購(gòu)自濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司。

1.2 病毒分離鑒定

按照國(guó)標(biāo)《新城疫診斷技術(shù)》（GB16550—2008）規(guī)定方法，將采集的樣品接種9～11 日齡SPF 雞胚。每個(gè)樣品接種2 枚雞胚，37 ℃孵育，棄掉24 h 內(nèi)死胚；96 h 后，收獲雞胚尿囊液，進(jìn)行血凝（HA）、血凝抑制（HI）試驗(yàn)；分裝鑒定為NDV 陽(yáng)性的尿囊液，-80 ℃保存。

1.3 RNA 提取

采用High Pure Viral RNA Kit（Roche）提取病毒RNA，將提取的RNA 立即用于RT-PCR 擴(kuò)增或者于-20 ℃保存。

1.4 RT-PCR 鑒定

采用本實(shí)驗(yàn)室建立的RT-PCR 方法[13]，利用Hiscript High Fidelity One Step RT-PCR Kit（Vazyme）擴(kuò)增病毒F基因。引物序列見(jiàn)表1。RT-PCR 反應(yīng)條件為：50 ℃ 30 min；94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 6 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，陽(yáng)性樣品送青島睿博興科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

表1 I 類NDV 鑒定引物

1.5 遺傳進(jìn)化分析

利用MEGA 6 軟件，對(duì)毒株F基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析；采用鄰位相連法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 I 類NDV 監(jiān)測(cè)

2016—2019 年，按照《國(guó)家動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃》，在安徽、江蘇、上海等23個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）開(kāi)展了新城疫病原學(xué)主動(dòng)監(jiān)測(cè)，在998 個(gè)采樣點(diǎn)共采集家禽口咽/泄殖腔拭子、野鳥(niǎo)糞便樣本和環(huán)境樣本45 458 份，經(jīng)病毒分離、RT-PCR 鑒定和序列測(cè)定，共分離到I類NDV 558 株，病毒陽(yáng)性率為1.23%（95%CI，1.13%～1.33%）。其中，2018年I類NDV陽(yáng)性率最高，為1.88%（表2）。558 株病毒主要來(lái)源于雞（403株）和鴨（126 株），少量來(lái)自鵝、鴿和環(huán)境樣本（表3）。野鳥(niǎo)糞便樣本中未檢測(cè)到病毒。

2016—2019 年分離的558 株I 類NDV 來(lái)源于安徽、福建、廣東、廣西、貴州、湖北、江蘇、江西、寧夏、上海、四川、云南、西藏、青海、新疆和浙江等16 個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）的127 個(gè)采樣點(diǎn)，主要分布于我國(guó)華東、西南和西北地區(qū)，其中，廣東、廣西、江蘇、江西、寧夏、上海、云南等地連續(xù)4 年分離到I 類NDV。監(jiān)測(cè)到I 類NDV 的127 個(gè)采樣點(diǎn)包括，31 個(gè)活禽批發(fā)市場(chǎng)、91 個(gè)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、3 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)和2 個(gè)屠宰場(chǎng)?；钋菖l(fā)市場(chǎng)和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)年均病毒陽(yáng)性率分別為28.70%和24.33%（圖1），明顯高于養(yǎng)殖場(chǎng)和屠宰場(chǎng)（P＜0.05）。

表2 2016—2019 年I 類NDV 主動(dòng)監(jiān)測(cè)病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.2 I 類NDV 遺傳進(jìn)化分析

遺傳進(jìn)化分析結(jié)果（圖2）顯示：2016—2019年分離的558 株I 類NDV 分屬于2 種基因亞型：1.1.2 亞型551 株、1.2 亞型7 株。其中，1.1.2 亞型為目前我國(guó)家禽中流行的優(yōu)勢(shì)基因亞型，在我國(guó)16 個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）家禽中均分離到；1.2基因亞型均為鴨源分離株，分別于2016 年和2018年分離自寧夏、江蘇和廣西等地。

3 討論

圖1 不同采樣點(diǎn)I 類NDV 陽(yáng)性率分布

表3 2016—2019 年I 類NDV 宿主分布

圖2 2016—2019 年I 類NDV F 基因進(jìn)化樹(shù)

1926 年3 月，印度尼西亞在爪哇島首次發(fā)現(xiàn)新城疫，隨后英格蘭、朝鮮、印度、斯里蘭卡、菲律賓、日本和澳大利亞等國(guó)也相繼報(bào)道發(fā)生新城疫。迄今為止，該病已蔓延至世界各地，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重危害。毒株遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，NDV 可分為I 類、II 類兩大類[14]。I 類NDV 出現(xiàn)較晚，2003 年首次在法國(guó)野生麻鴨中分離到，早期主要存在于野生水禽和野鳥(niǎo)中，隨后在活禽市場(chǎng)家禽中被陸續(xù)分離到[2-4]。早期基因分型方法將I 類NDV分為至少10 個(gè)基因型[2]，國(guó)內(nèi)流行毒株主要為基因2 型 和3 型[7，12]。2012 年，Diel 等[14]將I 類NDV 合并為1 個(gè)基因型，但細(xì)分為3 個(gè)基因亞型（1a、1b 和1c）。我國(guó)流行毒株主要為基因1b 亞型。2019 年，全球9 家OIE 新城疫參考實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合20 家國(guó)際著名實(shí)驗(yàn)室更新了NDV 分類方法，將I 類NDV 劃分為1 個(gè)基因型3 個(gè)基因亞型（1.1.1、1.1.2 和1.2）[1]。我國(guó)早期分離株屬于1.1.1 和1.2基因亞型[5-6]。2016—2019 年我國(guó)分離的I 類NDV主要為1.1.2 基因亞型，只有7 株病毒屬于1.2 基因亞型。序列分析結(jié)果顯示，2016 年我國(guó)寧夏和江蘇分離的6 株1.2 基因亞型毒株與北美野生水鳥(niǎo)分離株高度同源。此類病毒于2015 年首次出現(xiàn)于我國(guó)廣西鴨群，但由于缺乏周邊國(guó)家新城疫監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，至今仍不清楚該毒株的確切來(lái)源[15]。

我國(guó)I 類NDV 污染面廣。2016—2019 年我國(guó)16 個(gè)省（自治區(qū)、直轄市）127 個(gè)采樣點(diǎn)均分離到I 類NDV。2011—2015 年監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)表明，I類NDV 主要分布于我國(guó)華東、華中、華南和西南等東部和南部地區(qū)[12]。本研究結(jié)果顯示，近年來(lái)I類NDV 主要分離自我國(guó)華東、西南和西北地區(qū)，暗示病毒正逐漸從我國(guó)東部和南部向西部蔓延。活禽批發(fā)市場(chǎng)和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)是I類NDV的高污染場(chǎng)點(diǎn)。本研究在活禽市場(chǎng)的雞、鴨、鵝、鴿等家禽和環(huán)境樣本中均分離到I 類NDV。部分活禽市場(chǎng)中，家禽免疫情況不明，多種禽類混養(yǎng)，市場(chǎng)衛(wèi)生條件較差，這些因素極易導(dǎo)致病毒傳播。因此，應(yīng)加強(qiáng)活禽市場(chǎng)的生物安全管理，積極采取消毒、休市等措施。2017—2018 年，本研究在少數(shù)養(yǎng)殖場(chǎng)中也分離到I 類NDV。I 類NDV 雖為弱毒株，使感染雞不表現(xiàn)明顯臨床癥狀，但在雞體內(nèi)連續(xù)傳代后，可能通過(guò)基因變異增強(qiáng)毒力。因此，在家禽飼養(yǎng)過(guò)程中，應(yīng)制定科學(xué)的免疫程序，做好疫苗免疫和抗體監(jiān)測(cè)，同時(shí)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，改善養(yǎng)殖環(huán)境，提高家禽抵抗力，降低病毒感染、變異和傳播的風(fēng)險(xiǎn)。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)I 類NDV 污染面廣，宿主范圍廣泛，且存在2 種基因亞型。建議加強(qiáng)飼養(yǎng)家禽I 類NDV 的免疫、監(jiān)測(cè)，同時(shí)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，提高家禽抵抗力，降低病毒基因變異使毒力增強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)。