一種基于亮氨酸氨基肽酶前藥分子的中間體合成及其藥物緩釋機(jī)制設(shè)計(jì)

曾繁明，宋振升，王飛翼，馬超，楊桂春

(1. 有機(jī)功能分子合成與應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖北大學(xué))， 湖北 武漢 430062；2. 武漢材料保護(hù)研究所， 湖北 武漢 430030)

0 引言

癌癥是威脅人類健康的重要疾病，也是目前亟待解決的健康問題之一.目前，癌癥的主要治療方法包括放射治療、手術(shù)治療和化學(xué)治療等[1-4]，其中化學(xué)治療是目前癌癥治療較為便捷的方式之一，但由于化學(xué)抗癌藥物普遍存在藥物作用選擇性不高和毒性較大等缺陷，對(duì)正常細(xì)胞和組織造成較大損傷，因而使化學(xué)抗癌藥物的發(fā)展受到較大阻礙[3-7].近年來，具有靶向性的前藥分子作為癌癥治療的新興技術(shù)受到科研工作者們的廣泛關(guān)注，該類前藥分子能夠利用腫瘤組織或細(xì)胞的特殊特性觸發(fā)前藥分子在腫瘤細(xì)胞或組織中釋放出抗癌藥物，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的精準(zhǔn)殺傷，從而最終減小化學(xué)藥物治療的副作用并提高抗癌藥物的治療功效.結(jié)合熒光染料(熒光信號(hào)輸出)的新型抗癌前藥分子甚至可以實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物的釋放和定位進(jìn)行實(shí)時(shí)跟蹤監(jiān)測(cè)[8-12]，非常有利于癌癥治療效果的深入研究.

喜樹堿(Camptothecin，簡(jiǎn)稱 CPT)是目前應(yīng)用較為廣泛的抗癌藥物之一，基于CPT研發(fā)的抗癌前藥分子已經(jīng)有一些報(bào)道，例如：Wu等[13]構(gòu)建了利用光控觸發(fā)藥物釋放的前藥分子，實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞的高效殺傷；Zhu等[14]設(shè)計(jì)合成以生物硫醇類化合物(谷胱甘肽：GSH)觸發(fā)藥物釋放的前藥分子Cy-S-CPT；Kim等[15]構(gòu)建的活性氧類(ROS)化合物觸發(fā)CPT釋放的前藥分子，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞精準(zhǔn)殺傷等.這些前藥分子在光、生物硫醇類小分子和活性氧等途徑下在腫瘤組織中被激活并釋放抗癌藥物CPT，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的精準(zhǔn)殺傷.然而，到目前為止，利用腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)的生物酶觸發(fā)前藥分子藥物釋放的工作卻鮮有報(bào)道.

圖1 前藥分子中間體CPT-Leu-OH結(jié)構(gòu)示意圖

亮氨酸氨基肽酶(Leucine aminopeptidase, 簡(jiǎn)稱LAP)是生物體內(nèi)一種重要的蛋白水解酶，研究表明LAP可作為癌癥等諸多疾病診斷和愈后監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)[16-18]，例如LAP與卵巢上皮惡性腫瘤和乳腺癌的發(fā)展緊密相關(guān)[19-20]，然而目前基于LAP酶激活的前藥分子還未見報(bào)道，因而推動(dòng)發(fā)展基于LAP酶激活的前藥分子，實(shí)現(xiàn)對(duì)LAP相關(guān)癌癥的診療一體化研究將具有非常重要的意義.以此為目的，本文中我們嘗試設(shè)計(jì)合成一種前藥分子中間體CPT-Leu-OH(如圖1所示)，期望以該中間體為平臺(tái)，推動(dòng)構(gòu)建基于LAP觸控的前藥分子.CPT-Leu-OH以L-亮氨酸殘基為LAP酶的特異性觸發(fā)基團(tuán)，CPT為基礎(chǔ)抗癌藥物，該中間體還保留有易于修飾的活性基團(tuán)-羥基，有利于后續(xù)引入各種熒光信號(hào)輸出基團(tuán)，從而最終構(gòu)建基于LAP的前藥分子，為LAP相關(guān)癌癥的診療提供新的方法參考.

1 合成部分

1.1 試劑和儀器試劑：對(duì)氨基苯甲醇，Boc-L-亮氨酸，碳酸鉀，N, N-二異丙基乙胺，1-羥基苯并三唑，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，三溴化磷，2-羥基-5-甲基間苯二甲醇，喜樹堿，N, N-二甲氨基吡啶，三光氣，N, N-二甲基甲酰胺，四氫呋喃，二氯甲烷，丙酮，乙腈，甲醇.實(shí)驗(yàn)中所用到的試劑和藥品均是采購于商業(yè)供應(yīng)商.二氯甲烷、丙酮、乙腈需除去水后使用，其他試劑不需要經(jīng)過再次純化等處理即可直接使用.

儀器：核磁共振儀WIPM 400 M(中國科學(xué)院)、液-質(zhì)聯(lián)用儀Waters LCT Premier XE(安捷倫科技有限公司)、pH計(jì)FiveEasy Plus(瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)).

1.2 合成路線的設(shè)計(jì)合成路線如圖2所示.

圖2 化合物CPT-Leu-OH的合成路線圖

1.3 合成步驟化合物1的合成：在干燥的100 mL燒瓶中，將對(duì)氨基苯甲醇(1.23 g，10.00 mmol)溶解在15.00 mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，在0 ℃的條件下，用注射器緩慢加入N,N-二異丙基乙胺(DIPEA，3.40 mL)，攪拌15 min，再將溶于一定量干燥DMF的1-羥基苯并三唑一水物(HOBT，1.35 g，10.00 mmol)緩慢加入其中，繼續(xù)攪拌15 min，然后將1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCl，1.92 g，10.00 mmol)緩慢加入，攪拌20 min后，在0 ℃下，將溶解在一定量干燥DMF中的Boc-L-亮氨酸(2.77 g，12.00 mmol)緩慢加入到上述反應(yīng)體系中，攪拌30 min，然后恢復(fù)到室溫繼續(xù)反應(yīng)4 h.反應(yīng)結(jié)束后，每次用20 mL乙酸乙酯(EA)將反應(yīng)液萃取3次，然后減壓蒸餾濃縮除去溶劑，得到殘留物通過硅膠柱層析色譜法純化，乙酸乙酯/石油醚為洗脫液(PE∶EA=4∶1,V/V)，得到化合物1為白色固體(2.76 g，產(chǎn)率82.14%).

化合物2的合成：在氬氣氛圍的保護(hù)下，將化合物1(1.35 g，4.00 mmol)溶解在30.00 mL干燥的四氫呋喃(THF)中，在0 ℃下，用注射器將稀釋有PBr3(184.00 μL，3.00 mmol)的5.00 mL干燥THF緩慢加入反應(yīng)體系中，在0 ℃下攪拌3 h.反應(yīng)結(jié)束后，將混合物用 100.00 mL冰水稀釋，然后加入一定量的飽和NaHCO3溶液.用乙酸乙酯萃取三次稀釋液(30 mL× 3)，然后用無水硫酸鈉干燥，過濾.然后減壓蒸餾濃縮除去溶劑，得到殘留物通過使用硅膠柱層析色譜法純化，乙酸乙酯/石油醚為洗脫液(PE∶EA=2∶1,V/V)，得到化合物2為白色固體(1.21 g，產(chǎn)率76.10%).

化合物3的合成：將化合物2(501.63 mg，1.26 mmol)和2-羥基-5-甲基間苯二甲醇(847.12 mg，5.04 mmol)加入到干燥的三頸燒瓶中，在氬氣的保護(hù)下，加入干燥的丙酮使其溶解，在70 ℃下加熱回流15 h.反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸餾除去溶劑，通過使用硅膠柱層析色譜法純化殘余物，乙酸乙酯/石油醚為洗脫液(1∶1,V/V)，得到化合物3，為白色固體(398.15 mg，產(chǎn)率65.02%).1H NMR (400 MHz, CD3OD)：δ： 9.98 (s, 1H), 7.62 (d,J=8.5 Hz, 2H), 7.38 (d,J=8.3 Hz, 2H), 7.13 (s, 2H), 7.01 (d,J=8.2 Hz, 1H), 5.01 (t,J=5.5 Hz, 2H), 4.74 (s, 2H), 4.50 (d,J=5.1 Hz, 4H), 4.12 (s, 1H),2.49 (t,J=5.3 Hz, 2H), 2.27 (s, 3H), 1.38 (s, 10H), 0.89 (dd,J=6.3, 4.3 Hz, 6H).

化合物CPT-Leu-OH的合成：在氬氣氛圍下，將DMAP(72.00 mg，0.59 mmol)和CPT(104.00 mg，0.30 mmol)溶解在干燥的二氯甲烷(25.00 mL)中，在0 ℃下，將三光氣(30.00 mg，0.10 mmol)溶解在3 mL的干燥的二氯甲烷中，用注射器緩慢加入到反應(yīng)體系中，反應(yīng)30 min，將化合物3(48.63 mg，0.10 mmol)溶解在5.00 mL干燥二氯甲烷中，將其緩慢加入混合液中，然后在室溫下反應(yīng)15 h.反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸餾除去溶劑，通過使用硅膠柱層析色譜法純化殘余物，二氯甲烷/甲醇為洗脫液(20∶1)，得到化合物CPT-Leu-OH(38.26 mg，產(chǎn)率44.50 %)，為白色固體.1H NMR (400 MHz, CD3OD)：δ： 8.66 (s, 1H), 8.31 (s, 1H), 8.13 (d,J=8.5 Hz, 1H), 7.92 (d,J=8.1 Hz, 1H), 7.82 (t,J=7.6 Hz, 1H), 7.66 (t,J=7.5 Hz, 1H), 7.29 (s, 2H), 7.24 (s, 1H), 7.18 (s, 1H), 7.11 (s, 2H), 7.04 (d,J=7.0 Hz, 1H), 5.61 (d,J=17.2 Hz, 1H), 5.34 (d,J=17.2 Hz, 1H), 5.23 (d,J=11.6 Hz, 2H), 5.19 (s, 2H), 5.10 (d,J=8.2 Hz, 1H), 4.65 (s, 2H), 4.59 (s, 2H), 4.20 (s, 1H), 3.65 (t,J=6.6 Hz, 2H), 2.20 (s, 3H), 1.60～1.50 (m, 3H), 1.44 (s, 9H), 1.37 (s, 2H), 0.95 (s, 8H); HRMS (ESI,m/z): [M+H]+Calcd. for C48H53N4O11+: 861.3596, Found: 861.3591.

1.4 化合物的表征合成出上述目標(biāo)化合物后，采用核磁共振氫譜(1H NMR)和高分辨質(zhì)譜(HRMS)對(duì)化合物進(jìn)行測(cè)定和結(jié)構(gòu)表征.相關(guān)譜圖分析的結(jié)果表明；合成的亮氨酸氨基肽酶前藥分子的中間體CPT-Leu-OH的結(jié)構(gòu)與測(cè)定的相符.

圖3為化合物3的1H NMR譜圖，圖中化學(xué)位移為2.27處為2-羥基-5-甲基間苯二甲醇部分上的甲基峰，7.00為其苯環(huán)上的氫特征峰，7.38和7.68為化合物2部分上的苯環(huán)上氫特征峰，9.98為識(shí)別基團(tuán)酰胺鍵上氫的峰，說明成功合成了化合物3.圖4為化合物CPT-Leu-OH的1H NMR譜圖，圖中化學(xué)位移1.44為化合物3部分上的Boc保護(hù)基上的氫，7.11～7.29為CPT苯環(huán)上的氫特征峰，說明CPT成功接入化合物3上，得到化合物CPT-Leu-OH.

圖3 化合物3的1H NMR譜圖

圖5為化合物CPT-Leu-OH的高分辨質(zhì)譜(HRMS)測(cè)試圖，HRMS (ESI,m/z): [M+H]+計(jì)算值：C48H53N4O11+：861.359 6，高分辨質(zhì)譜檢測(cè)值：861.359 1，[M+Na]+計(jì)算值：C48H52N4O11Na+：883.341 0，高分辨質(zhì)譜檢測(cè)值：883.340 5，從圖中可以看出高分辨質(zhì)譜(HRMS)測(cè)試檢測(cè)的質(zhì)荷比與理論計(jì)算所得分子的質(zhì)荷比的數(shù)值接近，證明化合物CPT-Leu-OH的結(jié)構(gòu)正確性.

2 藥物釋放機(jī)制與展望

在設(shè)計(jì)合成前藥分子中間體CPT-Leu-OH的過程中，我們?cè)谠摶衔锏慕Y(jié)構(gòu)上保留有易于修飾的活性基團(tuán)-羥基，有利于后續(xù)引入各種熒光信號(hào)輸出基團(tuán)，從而最終構(gòu)建基于亮氨酸氨基肽酶的前藥分子.

如圖6所示，我們以引入近紅外熒光團(tuán)(R)對(duì)前藥分子中間體CPT-Leu-OH進(jìn)行修飾，然后通過進(jìn)一步的脫甲基.以得到基于LAP酶激活的前藥分子為例：當(dāng)前藥分子與LAP相互作用時(shí)，前藥分子結(jié)構(gòu)中的LAP識(shí)別基團(tuán)部分的酰胺鍵會(huì)被LAP酶特異性裂解，裸露出自由胺基，而自由胺基上的孤對(duì)電子會(huì)沿著共軛體系發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，引起芐基C—O鍵斷裂，并進(jìn)一步促使碳酸脂鍵裂解釋放出抗癌藥物CPT，同時(shí)作為熒光信號(hào)輸出的熒光團(tuán)也會(huì)被激活釋放出來，引起熒光信號(hào)發(fā)生變化.該過程在釋放抗癌藥物殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，也通過熒光信號(hào)的輸出，達(dá)到監(jiān)測(cè)藥物釋放過程的目的，因而有利于對(duì)前藥分子的診療效果進(jìn)行更加深入研究.

圖4 化合物CPT-Leu-OH的1H NMR譜圖

圖5 化合物CPT-Leu-OH的高分辨(HRMS)質(zhì)譜圖

圖6 前藥分子的響應(yīng)機(jī)理示意圖

3 結(jié)論

通過上述研究工作，我們?cè)O(shè)計(jì)合成一種基于亮氨酸氨基肽酶的前藥分子中間體CPT-Leu-OH，以該中間體為平臺(tái)，有利于構(gòu)建基于LAP觸控的前藥分子，用于癌癥診療一體化研究.CPT-Leu-OH以L-亮氨酸殘基基團(tuán)作為LAP酶的特異性識(shí)別基團(tuán)，以喜樹堿CPT作為抗癌藥物分子，同時(shí)在該化合物的結(jié)構(gòu)上保留有易于修飾的活性基團(tuán)-羥基，有利于后續(xù)引入各種熒光信號(hào)輸出基團(tuán)，從而最終構(gòu)建基于亮氨酸氨基肽酶的前藥分子，為LAP相關(guān)癌癥的診療提供新的方法參考.