不同水解酶組合對黃姜細胞壁降解和皂苷釋放量的影響及其結(jié)構(gòu)特征分析

喻書誠，喻家欣，魏蜜,2，郭娟娟

(1. 湖北工程學(xué)院特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點實驗室/生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 湖北 孝感 432000;2. 華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 湖北 武漢 430074)

0 引言

黃姜，學(xué)名盾葉薯蕷(DioscoreaZingiberensisC.H.Wright)，為我國特有的藥食同源性野生植物資源[1]. 生產(chǎn)加工地主要集中于湖北十堰丹江口、陜西安康等地[2]. 其根狀莖含1.1%～16.5%的皂素，是目前世界上最好的激素藥物原料[3-4]. 另外，其水溶性甾體皂苷成分對高血脂癥、心肌缺血、胸痹、腫瘤等有極為顯著的治療效果[5].

由于黃姜根莖中含有大量淀粉和木質(zhì)纖維素，傳統(tǒng)的直接酸水解生產(chǎn)工藝具有酸用量大、污染嚴重、提取率低等缺點[6]，嚴重制約了皂素產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，其中的污染問題更是影響到了我國南水北調(diào)工程的水源質(zhì)量，亟待尋求能清潔生產(chǎn)黃姜皂素的工藝技術(shù)以擺脫當前困境. 近年來，將酶預(yù)處理技術(shù)應(yīng)用于優(yōu)化皂素的提取生產(chǎn)工藝呈現(xiàn)上升趨勢[7-9]. 通過選取合適的酶組合作用，高效降解細胞壁組分以及胞外的顆粒狀淀粉，使被包裹皂苷充分釋放，進而提升皂素得率. 同時，降低酸用量，減少廢水排放，避免環(huán)境污染問題[10]. 徐升運等[11]建立的生物酶法提取黃姜皂素，使皂素收率提升了26%，酸用量降低了74.7%. 王焰新等[3]利用糖化酶液化酶聯(lián)合處理黃姜原料中淀粉，建立了糖化-膜回收-水解(SMRH)清潔生產(chǎn)工藝.

值得注意的是，已有研究表明，不同的酶與酶、底物與酶之間存在協(xié)同或抑制作用[12-14]. 但是，不同的水解酶組合及作用次序?qū)υ硭氐寐实挠绊?、以及黃姜細胞壁生物質(zhì)降解的具體過程與作用機制仍缺乏研究. 因此，本實驗以富含木質(zhì)纖維素的藥用植物黃姜為對象，研究不同多糖降解酶組成及作用次序?qū)S姜細胞壁生物質(zhì)降解和皂苷分離的影響和內(nèi)在機制，為指導(dǎo)今后針對性的選取能分泌單一酶或復(fù)合酶系的微生物功能菌群聯(lián)合作用于黃姜生物質(zhì)，實現(xiàn)黃姜皂素的清潔生產(chǎn)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑黃姜由湖北省十堰市竹溪縣康輝生物化工有限責任公司提供；濃硫酸(分析純) ，開封東大化工有限公司；甲醇(分析純)，國藥集團；3,5-二硝基水楊酸(化學(xué)純)，上海展云化工有限公司；苯酚(分析純)，麥克林生化科技有限公司；糖化酶(100 000 U/mL)、α-淀粉酶(2 000 U/g)、纖維素酶(1 800 U/mg)、果膠酶(1 000 U/mg)、木聚糖酶(50 000 U/mg)以及黃姜皂素標準品均來自于上海金穗生物科技有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備紫外-可見光分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；電子天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；超純水處理器，成都滲源科技有限公司；高速離心機，北京時代北利離心機有限公司；超聲儀，上海之信儀器有限公司；電磁加熱攪拌器，鞏義市科華儀器設(shè)備有限公司；高效液相色譜儀，美國Agilent公司.

1.3 試驗方法

1.3.1 酶處理 低壓蒸汽膨化(low pressure steam expansion, LSEP)處理能顯著破壞黃姜細胞結(jié)構(gòu)促進皂素釋放[15]. 將經(jīng)LSEP處理的黃姜粉末依次添加酶試劑處理. 所有酶添加量均為150 U/g黃姜干粉. 其中，纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶酶促反應(yīng)在溫度50 ℃，pH為5.0的條件下處理20 h；α-淀粉酶酶促反應(yīng)在溫度95 ℃，pH為5.0的條件下處理30 min；糖化酶酶促反應(yīng)在溫度50 ℃，pH為5.0的條件下處理6 h.

P、X、C分別代表果膠酶處理、木聚糖酶處理、纖維素酶處理，PX即為果膠酶、木聚糖酶依次聯(lián)合處理；XP：木聚糖酶、果膠酶依次聯(lián)合處理；PC、CP、CX、XC依此類推；PXC：果膠酶、木聚糖酶、纖維素酶依次聯(lián)合處理；PCX：果膠酶、纖維素酶、木聚糖酶依次聯(lián)合處理；XPC、XCP、CPX、CXP依此類推；CK：空白對照. 所有處理組包括PXC、PCX、XPC、XCP、CPX、CXP、PX、XP、PC、CP、XC、CX、P、X、C以及CK共16組處理. 將經(jīng)過上述16組不同酶試劑組合及作用次序的處理定義為TE處理組. 在此基礎(chǔ)上，繼續(xù)添加α-淀粉酶、糖化酶進行糖化液化的處理組為FE處理組.

1.3.2 還原糖測定

1)還原糖測定方法的建立 借鑒王天龍等[16]優(yōu)化的DNS還原糖測定法. 精密取1 mL樣品上清液，加入2 mL配置靜止14 d后的DNS試劑，沸水水浴5 min，取出后立即冷卻并定容至10 mL，以蒸餾水為空白對照，在540 nm波長處測定吸光度. 實驗中將樣品酶處理水解液稀釋10～20倍進行檢測.

2)葡萄糖標準曲線的制作 精確稱取無水葡萄糖，用蒸餾水配置成濃度為2、3、4、9、11 mg/mL系列濃度的對照品溶液，采用DNS法測定. 以葡萄糖標準品濃度為橫坐標，吸光度OD值為縱坐標，制作還原糖標準曲線. 以O(shè)D值(Y)對樣品濃度(X)進行線性回歸，得還原糖回歸方程：y=0.071 6x-0.167 9，其決定系數(shù)R2=0.997 6. 用此公式可以準確計算出樣品還原糖濃度及含量.

1.3.3 黃姜皂素測定方法

1)色譜條件的建立 色譜柱：C18反相柱(syncronis C18250 mm×4.6 mm)，檢測波長204 nm，流動相為純甲醇，柱溫30 ℃，流速1 mL/min，進樣量10 μL，分析時間13 min.

2)薯蕷皂苷元標準曲線的制作 精密稱量薯蕷皂苷元標準品，用甲醇溶解制成0.052 5 mg/mL、0.105 0 mg/mL、0.175 0 mg/mL、0.210 0 mg/mL、0.262 5 mg/mL系列濃度的對照溶液，采用高效液相色譜法測定. 以對照溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，制作標準曲線. 以峰面積(Y)對樣品濃度(X)進行回歸分析，得到方程：y=4 229.6x+69.991其決定系數(shù)R2=0.999 4，用此方程可以精準計算出樣品薯蕷皂苷元濃度及含量.

1.3.4 黃姜樣品表征技術(shù)方法

1)環(huán)境掃描電鏡(SEM)方法 使用蔡司sigma 300電鏡. 黃姜渣烘干并研磨，過100目篩，取少量粉末樣品放于導(dǎo)電膠上用氣鼓吹掉未粘牢的粉末，將樣品置于噴金儀內(nèi)噴金(1 min以內(nèi)). 將樣品臺放置于儀器中，抽真空開機觀察形貌.

2)X線衍射分析(XRD)方法 黃姜渣烘干并研磨，過100目篩. 將粉末樣品放入20 mm×20 mm×0.5 mm的玻璃載樣片中，壓實壓平. 將樣片放進艙內(nèi)，選擇1Dscan模式，狹縫2，電壓40 V電流150 mA，選擇合適的角度和測試速度開始測試.

3)低溫氮氣吸附-脫附法比表面積測定(BET)方法 使用麥克公司物理吸附儀ASAP2460. 取0.1～0.2 g過100目篩的黃姜粉末，抽真空脫氣6 h，裝上儀器分析口測試吸脫附曲線. 計算比表面積，孔容孔徑.

4)原子力顯微鏡分析(AFM)方法 儀器為Bruker Dimension Icon AFM，探針型號SCANASYST-AIR(彈性系數(shù)0.4 N/m)，采用智能掃描模式(Peak-force)掃圖. 掃描速率1.0 Hz，掃描像素256×256.

1.3.5 計算方法 含量=(V×C)/m，其中m：黃姜粉末質(zhì)量；V：樣品上清液體積；C：待測指標濃度.

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 所有測量數(shù)據(jù)至少3個平行樣品，以算數(shù)平均值±標準差(SD)表示. 用于表征微觀結(jié)構(gòu)(SEM、XRD、BET、AFM)的樣品，均來自于多組平行樣品的混合處理. 方差分析(ANOVA)采用 IBM SPSS Statistics 24進行Duncan檢驗.P值小于0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果分析

2.1 不同多糖水解酶組合及作用順序?qū)€原糖含量的影響TE處理組樣品中還原糖含量及單因素方差分析結(jié)果見圖1. TE處理組中，PC組與PCX組還原糖百分得率分別為13.601%、13.459%. 單因素方差分析結(jié)果表明，這兩個處理組中還原糖含量無顯著差異(*P>0.05)，考慮到酶成本，PC處理組是破壞黃姜細胞壁的最優(yōu)酶組合. 另外，P處理組樣品還原糖含量為12.558%，與最優(yōu)組PC對比，其還原糖含量水平僅降低1.043%，且通過唯一果膠酶處理的樣品，還原糖含量高于多種組合酶處理組，證實果膠酶是水解黃姜細胞壁組分的關(guān)鍵水解酶. 為進一步明確酶作用次序?qū)€原糖的影響，將PCX、CPX與CXP組進行對比、PC組與CP組進行對比，果膠酶優(yōu)先添加的樣品組PCX相較于CPX、CXP組還原糖含量分別提高0.749%、2.253%；PC組較CP組提升0.635%. 因此，在酶處理降解黃姜細胞壁的過程中，果膠酶應(yīng)最先添加. 另外，PCX組與PC處理組、CPX組與CP組還原糖含量并無顯著差異，說明木聚糖酶在提升還原糖含量方面作用不明顯.

圖1 不同酶組成及作用順序處理樣品的還原糖含量

2.2 不同多糖水解酶組合及作用順序?qū)υ硭氐寐实挠绊懰蠪E處理組中黃姜皂素提取率及單因素方差分析結(jié)果如圖2所示. PCX組、PC組、CPX組以及CP組皂素含量分別為1.550%、1.574%、1.510%和1.547%. 經(jīng)單因素方差分析，以上4組處理皂素含量差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(*P>0.05). 結(jié)合它們處理后PC、PCX組還原糖得率顯著高于其他組，以及酶成本問題，最終確定PC組為最優(yōu)處理組. 另外，P處理組皂素含量為1.293%，與最優(yōu)組PC比較，僅降低0.281%，證明果膠酶也是水解細胞壁釋放皂苷的關(guān)鍵水解酶，這點與果膠酶對還原糖提取率的影響效果一致. 同時，PCX與PC組；CP與CPX組兩兩比較，兩者的皂素含量差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(*P>0.05)，這一結(jié)果表明木聚糖酶在促進皂苷的釋放上效果不理想.

圖2 不同酶組合及作用順序處理樣品的黃姜皂素提取率

2.3 TE組處理后黃姜渣微觀結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 環(huán)境掃描電鏡(SEM)分析 對經(jīng)過不同酶處理組處理的黃姜渣進行SEM分析，結(jié)果顯示未經(jīng)酶處理的樣品中淀粉顆粒與木質(zhì)纖維素緊密的交織在一起，嚴重阻礙皂苷的釋放和游離(圖3，CK)；經(jīng)過木聚糖酶處理后的樣品細胞壁組分降解不顯著(圖3，X)，與上文還原糖、皂素的測定中所得結(jié)論一致；經(jīng)纖維素酶處理的樣品，淀粉顆粒依然很完整，木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)上無明顯穿孔(圖3，C). 相反地，凡是經(jīng)果膠酶或果膠酶復(fù)配的酶處理組樣品中，黃姜細胞壁均出現(xiàn)了明顯的孔洞結(jié)構(gòu)，且黃姜淀粉也被降解得更充分. 其中，PCX組與PC組樣品中，孔洞結(jié)構(gòu)極為明顯，細胞壁結(jié)構(gòu)破壞程度最為顯著. 因此，這兩個處理組水解產(chǎn)物的得率顯著高于其他處理組，這與還原糖測定中所得結(jié)論一致.

圖3 TE處理組黃姜渣的環(huán)境掃描電鏡圖片

圖4 TE處理組黃姜渣X線衍射圖譜

2.3.2 X線衍射(XRD)分析 結(jié)晶度對物質(zhì)的降解有極大的影響，高結(jié)晶度往往會使物質(zhì)分子排列得更為緊密，難于降解[17]. 因此，若能降低黃姜細胞壁中各組分的結(jié)晶度，將十分有利于被黃姜細胞壁包裹的黃姜皂苷的充分釋放. 由圖4可知，6種不同處理的黃姜樣品在2θ角為15.5°、17.0°、17.8°、22.7°、26.5°、29.9°左右均出現(xiàn)較強衍射峰. 使用軟件JADE 6.5分峰擬合法進行相對結(jié)晶度計算. 不同處理下黃姜樣品的相對結(jié)晶度分別為：X：25.09%；P：25.97%；C：25.77%；PC：25.22%；CP：25.59；PCX：25.13%. 單因素方差分析表明，各不同處理組樣品之間相對結(jié)晶度差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(*P>0.05). 因此，通過改變3種酶制劑的組合及作用順序，對黃姜生物質(zhì)整體的結(jié)晶度影響不大，但是如果是將黃姜生物質(zhì)中大小組分進行分級測定的話，可能對其結(jié)晶度和聚合度的影響會顯現(xiàn)出來.

2.3.3 低溫氮氣吸附-脫附法比表面積(BET)分析 底物比表面積的大小關(guān)系到酶分子催化作用的效率，直接影響皂素釋放的水平. 本實驗將果膠酶(P)參與的幾個重要組合(P、PC、PCX)進行BET分析，見表1. 結(jié)果表明，P處理組比表面積(8.1 602 m2/g)大于PC組(6.532 4 m2/g)與PCX組(4.708 5 m2/g)，且孔徑大小順序依次為P(4.629 5 nm)

表1 TE處理組黃姜渣結(jié)構(gòu)性質(zhì)

圖5 TE處理組黃姜渣表面形貌的原子力顯微鏡圖A、B為經(jīng)P組處理的黃姜粉末原子力顯微照片；C、D為 PCX組處理黃姜粉末原子力顯微照片

2.3.4 原子力顯微鏡(AFM)分析 基于BET分析結(jié)果，將比表面積差異最大的兩個組合(P、PCX)進行了AFM分析，得到如圖5所示掃描范圍為5 μm×5 μm的三維形態(tài)圖. 圖中以色度值的高低表示樣品表面高度的變化，色度值越高表示高度越高. 從原子力顯微圖中可以清晰地看見，經(jīng)過果膠酶處理后的樣品沉淀顆粒表面峰谷之間的極差為51.9 nm、70.1 nm(圖5，A、B)，大于經(jīng)果膠酶、纖維素酶、木聚糖酶依次處理的樣品(10.1 nm、9.6 nm；圖5，C、D). 表明，經(jīng)果膠酶處理的樣品沉淀顆粒表面更為粗糙，該結(jié)論與BET分析結(jié)論一致，推測導(dǎo)致此現(xiàn)象的原因是：在只有果膠酶處理時，果膠酶充分降解了細胞壁與細胞之間粘粘的果膠質(zhì)，使得細胞之間最大限度地分散促使表面積增加；在果膠酶、纖維素酶和木聚糖酶依次聯(lián)合處理的情況下，它們最大限度地降解了細胞壁纖維素、果膠質(zhì)等組分，致使黃姜渣表面的結(jié)構(gòu)反而變得更為平坦，且黃姜細胞壁表面形成的許多細小孔洞逐漸變大、孔隙縮小，孔洞不斷相互融合，孔洞結(jié)構(gòu)密集程度降低，導(dǎo)致黃姜渣比表面積比P組更低.

3 討論與結(jié)論

確定酶預(yù)處理過程中的關(guān)鍵酶類及最佳酶處理順序，對優(yōu)化以生物質(zhì)資源為原料，提取有效成分的生產(chǎn)工藝有重要意義. Song Young-Ran等[18]通過酶預(yù)處理法提取草本植物紫菀的新型多糖研究中，果膠酶處理組得率為3.8%，為最優(yōu)處理組. Sharma Rakesh等[19]利用單一酶或組合酶處理橄欖以提升橄欖油的產(chǎn)量和質(zhì)量，確定了果膠酶與纖維素酶1∶1混合加入時，最大采油率為11%. 本研究通過3種酶的不同組合及作用順序處理黃姜原料，以黃姜還原糖和皂素得率為評價指標，確定了果膠酶是促進黃姜細胞壁生物質(zhì)降解的關(guān)鍵酶分子，與上述研究報道類似. 另外，本研究還確定了果膠酶與纖維素酶依次處理時，可達到最高的水解糖得率；果膠酶與纖維素酶復(fù)合處理時在節(jié)約成本的同時可達到最高的皂素提取率，皂素得率為對照組的3.286倍.

通過SEM、XRD、BET、AFM微觀結(jié)構(gòu)表征技術(shù)能夠直觀地分析酶組成及作用順序?qū)S姜細胞壁的降解情況. Baby Kumaranthara Chacko等[20-21]通過環(huán)境掃描電鏡分析經(jīng)不同酶單獨或組合作用茴香籽和青椒，發(fā)現(xiàn)酶預(yù)處理后細胞壁出現(xiàn)大量裂縫，有利于胞內(nèi)物質(zhì)的游離. 也有研究表明，通過預(yù)處理技術(shù)降低結(jié)晶度，有利于有效成分的提取. 王文惠等[22]采用氫氧化鈉和臭氧兩步法對玉米秸稈進行預(yù)處理，顯著破壞了纖維素的晶體結(jié)構(gòu)，能極大促進纖維素的后續(xù)酶解. 在本研究中，XRD分析發(fā)現(xiàn)，3種酶的復(fù)合處理并不能改變黃姜細胞壁組分的結(jié)晶度. 這是因為本研究中各種酶預(yù)處理條件溫和，沒有進行高溫或添加酸堿介質(zhì)等處理.

本研究對比分析了16組不同多糖水解酶酶組合和作用順序?qū)S姜生物質(zhì)細胞壁降解及皂苷釋放的影響，結(jié)果表明，果膠酶是黃姜還原糖和皂素提取率的關(guān)鍵酶，PC組合是提取還原糖、皂素效率最高且成本最低的處理組. 同時，本研究聯(lián)合了SEM、XRD、AFM和BET 4種微觀結(jié)構(gòu)表征技術(shù)來闡明酶分子組合和作用順序?qū)S姜細胞壁降解的內(nèi)在原因. 該研究對不同酶組合處理富含木質(zhì)纖維素的藥用植物資源、降低生產(chǎn)過程對環(huán)境的污染、實現(xiàn)生產(chǎn)工藝清潔化及其產(chǎn)物的綜合利用提供了參考，對天然產(chǎn)物及其有效成分的清潔生產(chǎn)具有重要意義. 同時也為定向篩選能分泌特定細胞壁降解酶系的微生物的聯(lián)合處理生物質(zhì)資源指明了方向，這將是今后本研究需要繼續(xù)深入開展的工作.