地黃C3H基因的克隆及生物信息學(xué)分析

周延清 邵露營(yíng) 郭萌萌 朱佳琳

摘 要：香豆酸-3-羥化酶屬于植物中最大的蛋白酶細(xì)胞色素P450家族之一，在植物生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。為了解地黃香豆酸-3-羥化酶基因RgC3H合成毛蕊花糖苷的功能，該研究基于地黃代謝組學(xué)分析獲得KEGG途徑中的C3H，采用多重比對(duì)在NCBI中獲得同源基因的一個(gè)保守序列，并基于該保守序列和地黃SRA數(shù)據(jù)庫(kù)，采用電子克隆和RT-PCR克隆技術(shù)獲得地黃C3H基因全長(zhǎng)CDS（RgC3H），對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：RgC3H基因全長(zhǎng)為1 530 bp，且編碼一個(gè)含509個(gè)氨基酸、分子量為57.91 kD、無(wú)信號(hào)肽的蛋白質(zhì);基于氨基酸序列的結(jié)構(gòu)分析顯示，RgC3H有一個(gè)保守區(qū)域-P450結(jié)構(gòu)域;系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，RgC3H與芝麻和猴面花的C3H基因具有很高的同源性。上述結(jié)果為進(jìn)一步研究RgC3H基因在地黃毛蕊花糖苷生物合成途徑中的作用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：地黃，C3H基因，基因克隆，生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)：Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2020）09-1281-07

Abstract：Coumarin-3-hydroxylase belongs to the cytochrome P450 family，one of the largest protease families，and plays an important role in plants. However，its role for verbascoside biosynthesis remains deficient. In order to understand the role of P-coumarate 3-hydroxylase for verbascoside biosynthesis in Rehmannia glutinosa （RgC3H），C3H was mined from a candidate KEGG pathway based on the metabolomics analysis of R. glutinosa，and a conserved sequence of homologous gene was obtained in NCBI by multiple alignment. According to its fragment and SRA database of R. glutinosa，we cloned its full length CDS （RgC3H） by electro cloning and RT-PCR，and performed its bioinformatics analyses. The results were as follows：RgC3H gene was 1 530 bp in length and encoded a 509-amino acid protein with a molecular weight of 57.91 kD and without signal peptide; According to its amino acid sequence and structural analysis，RgC3H contained one conserved domain-cytochrome P450 domain，suggesting that it belonged to cytochrome P450 family; Phylogenetic tree analysis showed that RgC3H had high homology with the C3H genes of Sesamum indicum and Erythranthe guttata. This study laid a foundation for further research on the role of RgC3H gene in the pathway of verbascoside biosynthesis in Rehmannia glutinosa.

Key words：Rehmannia glutinosa，C3H gene，gene cloning，bioinformatics

地黃是“四大懷藥”之一，屬于玄參科地黃屬多年生草本植物，是一種重要的傳統(tǒng)中藥藥材，種類繁多，具有益陰生津、清涼熱血等功效。目前，有關(guān)地黃的基因不斷被挖掘和分析，如地黃纖維素合酶基因（周延清等，2015）、RgTPI基因（邵露營(yíng)等，2018）、RghBNG基因（張喻，2014）等，但明確相應(yīng)功能的基因并不多。

香豆酸-3-羥化酶（p-coumarate 3-hydroxylase，C3H）屬于細(xì)胞色素P450中的CYP98亞家族，細(xì)胞色素P450參與木質(zhì)素中間物的生物合成過(guò)程中，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用（賀麗虹等，2008）。目前，C3H基因已在擬南芥（Schoch et al.，2001）、慈竹（周美娟等，2012）、苧麻（袁有美等，2017）等植物中逐步被鑒定。C3H是毛蕊花糖苷等多種物質(zhì)生物合成途徑中的一條共有途徑-苯丙素途徑中的一個(gè)限速酶，地黃轉(zhuǎn)錄組測(cè)序挖掘出其Unigenes（Wang et al.，2017），地黃代謝組分析挖掘出C3H及其催化途徑（Zhou et al.，2018）。其與毛蕊花糖苷合成相關(guān)的作用被初步證實(shí)（Wang et al.，2017）。但是，地黃全長(zhǎng)C3H基因的克隆及生物信息學(xué)分析尚未見報(bào)道。本研究基于地黃代謝組分析挖掘的C3H，采用同源克隆、電子克隆技術(shù)結(jié)合RT-PCR的方法首次獲得了RgC3H全長(zhǎng)CDS，并對(duì)其堿基序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究其在地黃毛蕊花糖苷途徑中的作用及其他功能的開發(fā)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

地黃品種溫85-5塊根，種植于河南師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)田。獲得的RgC3H基因部分保守序列：GAGTTCAGACCCGAGAGGTTTCAAGAGGAGG

ACATCGACATGAAGGGGACCGATTATCGGCTACTTCCGTTCGGGTCAGGACGGCGTATTTGCCCCGGTGCACAACTTGCTATCAACTTGGTG。RgC3H基因引物序列為（F：5′-ATGGCTATCCCTCTCCTCAT-3′，R：5′- GCAAAAGAAAAGAACCATA-3′），引物序列合成于英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司。瓊脂糖、溴化乙錠（四川維克奇生物科技有限公司），DNA Marker（DL2 000）（寶生物生物技術(shù)公司）

1.2 方法

1.2.1 目的基因RgC3H全長(zhǎng)CDS的獲取 依據(jù)地黃代謝組學(xué)分析侯選KEGG通路挖掘出RgC3H酶（Zhou et al.，2018），并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載與地黃親緣關(guān)系較近物種的已知C3H的核苷酸序列進(jìn)行同源比對(duì)，獲得C3H部分保守序列。找到地黃相關(guān)的SRA數(shù)據(jù)庫(kù)在Nucleotide Blast中輸入已知的部分序列，選擇高度相似的序列檢索地黃SRA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行電子克隆。用ORF Finder軟件預(yù)測(cè)RgC3H的完整ORFs，利用軟件primer primer 5.0設(shè)計(jì)用于RT-PCR的引物，并以溫85-5塊根的cDNA為模板，RT-PCR反應(yīng)體系參照王向楠（2017）。RT-PCR 程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s，引物退火溫度為53 ℃，退火時(shí)間為30 s，72 ℃延伸時(shí)間2 min，35 cycle;72 ℃終延伸10 min。RT-PCR結(jié)束后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。產(chǎn)物膠回收后送至上海金唯智公司進(jìn)行測(cè)序得到RgC3H基因的編碼序列。

1.2.2 RgC3H的生物信息學(xué)分析 將測(cè)序得到的RgC3H完整CDS區(qū)，用NCBI在線分析工具ORF Finder查找該基因開放閱讀框ORF;用ProtParam對(duì)RgC3H蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析;用TMHMM 2.0和NetPhos 3.1 Server對(duì)RgC3H蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)和磷酸位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析;應(yīng)用Signal P-5.0對(duì)地黃RgC3H氨基酸序列進(jìn)行信號(hào)肽的分析。用SOPMA及SWISS-MODEL分別對(duì)RgC3H蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。用NCBI的CD search和InterProScan對(duì)RgC3H蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。利用NCBI在線工具Blast查找與RgC3H同源性較高的序列，運(yùn)用軟件DNAMAN6.0進(jìn)行同源性分析及采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因RgC3H全長(zhǎng)CDS的獲取

根據(jù)拼接得到的CDS序列設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示。PCR產(chǎn)物切膠回收送至上海金唯智公司進(jìn)行測(cè)序所得基因序列結(jié)果如圖2所示。CDS全長(zhǎng)為1 530 bp，編碼的蛋白共有509個(gè)氨基酸殘基。

2.2 RgC3H同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過(guò)NCBI的Blastn搜索與RgC3H基因核苷酸序列相似性較高的物種，用DNAMAN6.0多重比對(duì)結(jié)果表明RgC3H與芝麻[Sesamum indicum（NM_001304410.1）]、猴面花[Erythranthe guttata（XM_012972625.1）]、桃兒七[Sinopodophyllum hexandrum（KC110989.1）]、美花煙草[Nicotiana sylvestris（XM_009766650.1）]等物種的相似性分別依次為91%、82%、72%和70%（圖3）。

為進(jìn)一步研究RgC3H在其他植物之間的進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA 6.0進(jìn)行C3H蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建結(jié)果顯示，芝麻、猴面花與地黃親緣關(guān)系最近，率先聚為一支，后與美花煙草聚為一支，與相思木（Acacia koa，KX784942.1）、錦雞兒（Caragana sinica，HQ829858.1）、木槿（Hibiscus syriacus，JX003249.1）的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖4）。

2.3 RgC3H理化性質(zhì)、功能及結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

2.3.1 RgC3H理化性質(zhì) 應(yīng)用ProtParam對(duì)RgC3H進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)其分子式為C2608H4136N706O727S28，分子量為57 911.50，氨基酸總數(shù)為509，等電點(diǎn)（pI）為8.89，帶負(fù)電荷的殘基（Asp+Glu）總數(shù)為60，帶正電荷的殘基（Arg+Lys）總數(shù)為67，估計(jì)的半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為31.11，蛋白質(zhì)類型為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。脂肪指數(shù)為90.22，親水性的平均值（GRAVY）為-0.202。

2.3.2 RgC3H保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) 利用NCBI的Conserved Domain Database數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果表明RgC3H的保守結(jié)構(gòu)域含有P450超家族，即屬于細(xì)胞色素P450家族成員（圖5）。

2.3.3 RgC3H的跨膜區(qū)和磷酸化位點(diǎn)分析 用TMHMM2.0對(duì)RgC3H進(jìn)行分析，結(jié)果表明RgC3H沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)，且是膜外蛋白質(zhì)。用NetPhos 3.1 Server對(duì)RgC3H進(jìn)行磷酸化結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)得出，蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)有26個(gè);絲氨酸磷酸化位點(diǎn)有20個(gè);酪氨酸磷酸化位點(diǎn)有12個(gè)。

2.3.4 RgC3H信號(hào)肽分析 利用Signal P-5.0 對(duì)地黃RgC3H 氨基酸序列進(jìn)行信號(hào)肽的可能性分析，結(jié)果表明，RgC3H無(wú)信號(hào)肽，可推測(cè)該蛋白沒(méi)有跨膜運(yùn)輸功能，不是分泌型蛋白。

2.4 RgC3H二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

本文應(yīng)用SOPMA及SWISS-MODEL分別對(duì)RgC3H的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中α螺旋占最多，為50.69%，其次是無(wú)規(guī)卷曲占33.99%，延伸鏈占9.43%和β轉(zhuǎn)角占5.89%（圖6、圖7）。

3 討論與結(jié)論

地黃是一種大宗中草藥，具有很高的觀賞、食用及藥用價(jià)值，其主要生物活性成分毛蕊花糖苷對(duì)其藥效意義重大。毛蕊花糖苷具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、光保護(hù)、護(hù)肝、保護(hù)神經(jīng)和免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性（Li et al.，2019）。但是，地黃毛蕊花糖苷含量很低，我國(guó)藥典規(guī)定地黃毛蕊花糖苷含量不小于0.02%。因此，需要解析地黃毛蕊花糖苷生物合成途徑，探索提高地黃毛蕊花糖苷含量。毛蕊花糖苷生物合成途徑有一條重要的苯丙烷合成途徑，與木質(zhì)素合成途徑具有重疊步驟，而C3H正是兩者重疊途徑中的限速酶（Schoch et al.，2001），且前期研究已挖掘出了地黃C3H（Wang et al.，2017;Zhou et al.，2018 ）及其編碼基因RgC3H的Unigene（Wang et al.，2017）。但是，沒(méi)有克隆RgC3H全長(zhǎng)基因和深入研究其合成毛蕊花糖苷的作用。

本研究基于地黃代謝組分析挖掘出C3H，采用同源克隆、電子克隆技術(shù)結(jié)合RT-PCR的方法首次獲得了RgC3H全長(zhǎng)CDS，并對(duì)其堿基序列及其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，這些結(jié)果體現(xiàn)了我們建立的基因克隆技術(shù)具有綜合性、先進(jìn)性和有效性;RgC3H測(cè)序結(jié)果為1 530 bp，生物信息學(xué)分析表明其編碼509個(gè)氨基酸，具有C3H酶類的保守P450結(jié)構(gòu)域，這與前人從慈竹、苧麻、石榴等植物中克隆的C3H基因在基因大小、氨基酸殘基個(gè)數(shù)等方面的結(jié)果一致（周美娟等，2012;袁有美等，2017;熊楓等，2018）;RgC3H在氨基酸水平上與多種植物的C3H具有較高的同源性，且系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，地黃RgC3H基因與芝麻（NM_001304410.1）和猴面花（XM_012972625.1）的C3H基因相似性分別高達(dá)91%和82%，這與他們同屬于管狀花目植物的分類地位相一致;采用SOPMA預(yù)測(cè)RgC3H蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)表明該蛋白中主要由α螺旋和無(wú)規(guī)卷曲組成，延伸鏈和β轉(zhuǎn)角相對(duì)較少;經(jīng)信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析得出該蛋白是一種膜外蛋白質(zhì)，無(wú)信號(hào)肽，沒(méi)有跨膜運(yùn)輸功能。

綜上所述，本研究成功克隆并分析了地黃RgC3H基因，證明其屬于植物C3H基因家族。本研究工作的開展，擴(kuò)大了已知地黃基因數(shù)據(jù)，為下一步揭示RgC3H在地黃毛蕊花糖苷生物合成途徑中的作用提供了有價(jià)值的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。但是，RgC3H合成地黃毛蕊花糖苷的真正作用有待進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)：

ALIPIEVA K，KORKINA L，ORHAN IE，et al.，2014. Verbascoside—A review of its occurrence，（bio）synthesis and pharmacological significance [J]. Biotechnol Adv，32：1065-1076.

HE LH，ZHAO SJ，HU ZB，2008. Gene and function research progress of plant cytochrome p450s [J]. Pharm Biotechnol，15（2）：142-147.? [賀麗虹，趙淑娟，胡之壁，2008. 植物細(xì)胞色素p450基因與功能研究進(jìn)展 [J]. 藥物生物技術(shù)，15（2）： 142-147.]

KIM YS，RYUK JA，KO BS，2012. Discrimination of Korean Rehmannia glutinosa from Chinese Rehmannia glutinosa using sequence-characterized amplified region marker [J]. J Korean Soc Appl boil，55（1）：1-6.

LI G，YANG Q，ZHANG Y，et al.，2013. Cloning and sequence analysis of the ckc3h gene from Caragana korshinskii kom and preliminary studies of its function [J]. China Biotechnol，33（4）：61-67.

LI WT，DENG RX，JING XS，et al.，2019. Acteoside ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis through inhibiting peroxynitrite-mediated mitophagy activation [J]. Free Radical Biol Med. DOI：10.1016/j.freeradbiomed.2019.10.408.

SCHOCH G，GOEPFERT S，MORANT M，et al.，2001.CYP98A3 from Arabidopsis thaliana is a 3′-hydroxylase of phenolic esters，a missing link in the phenylpropanoid pathway [J]. J Biol Chem，276（39）：36566-36574.

SHAO LY，ZHOU YQ，YANG K，et al.，2018. Cloning and spatial expression of Triosephosphateisomerase gene in Rehmannia glutinosa [J]. J Henan Agric Sci，47 （11）：50-55.? [邵露營(yíng)，周延清，楊珂，等，2018. 地黃磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的克隆與空間表達(dá) [J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，47（11）：50-55.]

WANG FQ，ZHI JY，ZHANG ZY，et al.，2017. Transcriptome analysis of salicylic acid treatment in Rehmannia glutinosa hairy roots using RNA-seq technique for identification of genes involved in acteoside biosynthesism [J]. Front Plant Sci，8（17）：787-801.

WANG XN，2017. Mining and identification of verbascoside biosynthesis associated genes based on transcriptome sequencing of Rehmannia glutinosa [D]. Xinxiang：Henan Normal University：27-45.? [王向楠，2017. 基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的地黃毛蕊花糖苷生物合成相關(guān)酶基因的發(fā)掘與鑒定 [D]. 新鄉(xiāng)：河南師范大學(xué)：27-45.]

XIONG F，CHEN L，LIU TR，et al.，2018. Cloning and expression analysis of coumarate-3-hydroxylase C3H gene in? Punica granatum [J]. Mol Plant Breed，16（23）：7628-7633.? [熊楓，陳磊，劉同瑞，等，2018. 石榴對(duì)香豆酸-3-羥基化酶C3H基因的克隆和表達(dá)分析 [J]. 分子植物育種，16（23）：7628-7633.]

XIU ZM，PENG XP，CHEN JH，2017. Effects of down-regulated expression of Poplar lignin synthesis genes C3H and HCT on cell well spatial morphology [J]. J Shandong Sci Technol，47（1）：37-40.? [修則明，彭霄鵬，陳建輝，2017. 楊樹木質(zhì)素合成基因C3H與HTC表達(dá)下調(diào)對(duì)細(xì)胞壁空間形態(tài)的影響 [J]. 山東林業(yè)科技，47（1）：37-40.]

YUAN YM，CHEN JR，LIU F，et al.，2017. Gene cloning，bioinformatics and expression analysis on C3H gene from Boehmeria nivea L. [J]. Chin Agric Sci Bull，33（32）：21-27.? [袁有美，陳建榮，劉芳，等，2017. 苧麻C3H基因的克隆、生物信息學(xué)分析及表達(dá)分析 [J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，33（32）： 21-27.]

ZHANG DD，2018. Discovery and espressions of key verbascoside biosynthesis and glycolysis-associated enayme genes in Rehmannia glutinosa [D]. Xinxiang：Henan Normal University：25-28.? [張丹丹，2018. 地黃毛蕊花糖苷生物合成和糖酵解途徑相關(guān)關(guān)鍵酶基因的挖掘和表達(dá)分析 [D]. 新鄉(xiāng)：河南師范大學(xué)：25-28.]

ZHANG Y，2014. Cloning and bioinformatics analysis of RghBNG-like gene in Rehmannia glutinosa [D]. Xinxiang：Henan Normal University：29-35.? [張喻，2014. 地黃RghBNG基因的結(jié)構(gòu)分析和功能驗(yàn)證 [D]. 新鄉(xiāng)：河南師范大學(xué)：29-35.]

ZHOU MJ，HU SL，CAO Y，et al.，2012. Cloning and bioinformation analysis of C3H gene in Neosinocalamus affinis [J]. Bull Bot Res，32（1）：38-46.? [周美娟，胡尚連，曹穎，等，2012. 慈竹C3H基因克隆及其生物信息學(xué)分析 [J]. 植物研究，32（1）：38-46.]

ZHOU YQ，YANG K，ZHANG DD，et al.，2018. Metabolite accumulation and metabolic network in developing roots of Rehmannia glutinosa reveals its root developmental mechanism and quality [J]. Sci Rep，8（1）：14127-14137.

ZHOU YQ，WANG XN，WANG WS，et al.，2016. De novo transcriptome sequencing-based discovery and expression analyses of verbascoside biosynthesis-associated genes in Rehmannia glutinosa tuberous roots [J]. Mol Breed，36（10）：139-149.

ZHOU YQ，ZHANG Y，LI JY，et al.，2015. Cloning and bioinformatics analysis of cellulose synthase gene in Rehmannia glutinosa [J]. Jiangsu Agric Sci，1（43）：21-24.? [周延清，張喻，李靜云，等，2015. 地黃纖維素合酶基因的克隆及生物信息學(xué)分析 [J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，1（43）：21-24.]

（責(zé)任編輯 何永艷）