應(yīng)用蛋白質(zhì)組學技術(shù)篩選腎癌生物分子標志物的研究進展

喻小燕 石星云 陳鋒菊

摘 要：腎癌早期癥狀不明顯，無特異性指癥或癥狀，待確診時常已轉(zhuǎn)移，易延誤診斷。因此，腎癌的早期篩查和診斷至關(guān)重要。近年，腫瘤生物標志物已被廣泛應(yīng)用于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、診斷、指導(dǎo)治療等方面，如腫瘤生物分子標志物肝癌的甲胎蛋白（ AFP）、卵巢癌的 CA125 等。在腫瘤研究領(lǐng)域，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學技術(shù)研究腫瘤生物標志物成為新的熱點且已取得許多振奮人心的成果，基于蛋白質(zhì)組技術(shù)的腎癌生物標志物也進行了廣泛而深入的研究，本文重點介紹了近年來腎癌早期診斷、發(fā)展分期、術(shù)后監(jiān)測等方面的潛在生物標志物，為腎癌的早期診斷和治療提供更多依據(jù)。

關(guān)鍵詞：腎腫瘤;蛋白組學技術(shù);生物標志

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，占成人惡性腫瘤的2.2%。腎癌起病隱襲，早期缺乏特異性癥狀及體征，40%以上的腎癌確診時已到晚期，5年存活率難以達到10%[1]，但早期腎癌若經(jīng)過治療，5年存活率卻能高達 89%，因此，腎癌的早期篩查和診斷尤其重要。蛋白質(zhì)組技術(shù)的飛速發(fā)展為腎癌生物標志物的研究提供了新的技術(shù)平臺，廣大學者應(yīng)用高通量、高靈敏度的蛋白質(zhì)組學技術(shù)對腎癌生物標志物進行了廣泛而深入的研究，并取得了一定進展。現(xiàn)將這一領(lǐng)域近年發(fā)現(xiàn)的潛在生物標志物的研究結(jié)果及進展介紹如下。

1 應(yīng)用于腎癌診斷的生物標志物

1.1 煙酰胺N甲基轉(zhuǎn)移酶（nicotin-amide N-methyltransferase，NNMT）

煙酰胺N甲基轉(zhuǎn)移酶是人體內(nèi)重要的甲基化酶，是一種依賴性胞質(zhì)酶，該酶主要存在于細胞質(zhì)中，正常情況下，其正常表達于人肝臟組織中，而在心、腎等其他組織中表達低。它作為一種重要的酶參與物質(zhì)新陳代謝，廣泛的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。機體發(fā)生異常時，誘導(dǎo)煙酰胺發(fā)生甲基化反應(yīng)，從而影響細胞代謝和基因表達等，使其功能發(fā)生改變。Kim等[2]等采用雙向凝膠電泳-質(zhì)譜技術(shù)研究腎細胞癌及其癌旁組織樣本時發(fā)現(xiàn)，煙酞胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶在腎癌組織中表達明顯上調(diào)，進一步研究發(fā)現(xiàn)，在血清中水平也顯著上升。在對腎透明細胞癌、非腎透明細胞癌、良性腎腫瘤的分析檢測時，發(fā)現(xiàn)潛在的腎癌診斷分子生物標志物NNMT，經(jīng)使用免疫組化和 westernblot 進行進一步驗證，證明 NNMT 是所有類型腎癌中最常見的上調(diào)蛋白質(zhì)，分析認為，煙酰胺N甲基轉(zhuǎn)移酶可作為腎細胞癌診斷的獨立的血清學標志。在研究中，他們還發(fā)現(xiàn)鐵蛋白（ferritin）和人神經(jīng)元特異性烯醇化酶（hNSE）等蛋白在腎癌組織中表達也上調(diào)，經(jīng)分析和研究，它們與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等密切相關(guān)，NNMT聯(lián)合鐵蛋白和人神經(jīng)元特異性烯醇化酶的共表達可作為腎癌的一種新的血清標志物用于臨床診斷，這將為腎癌早期的診斷治療帶來新的曙光。但確切應(yīng)用價值還需要進一步的臨床驗證，目前，還沒有在臨床中廣泛應(yīng)用。

1.2 血清淀粉樣蛋白（serum amyloid A， SAA）

血清淀粉樣蛋白是一種急性反應(yīng)蛋白，經(jīng)肝細胞產(chǎn)生后分泌到血清，所以血清SAA的主要來源是肝臟。它是新的促炎性脂肪細胞因子，也是一種炎癥信號的觸發(fā)劑，當機體發(fā)生炎癥、損傷等時，SAA濃度明顯增加，靈敏性高。目前一些研究報道認為SAA不僅與炎癥性和急性損傷性疾病等有關(guān)，也與慢性疾病如心血管疾病、腫瘤等有關(guān)，在這些疾病中SAA表達量上升，并有報道認為不同分子質(zhì)量的SAA是腎癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、肺癌等的腫瘤標志物。Wood等[3]采用表面增強激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜（SELDI-TOF結(jié)合MS/MS）技術(shù)分析健康志愿者血清和腎細胞癌患者血清時發(fā)現(xiàn)，在腎癌術(shù)前血清中血清淀粉樣蛋白SAA特異性表達量顯著增高，多變量分析認為SAA可作為腎癌的潛在腫瘤標志物，也可作為腎癌預(yù)后的血清學候選標志。伊力亞爾等[4]應(yīng)用SELDI-TOF-MS 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)分析腎癌手術(shù)前后血清蛋白質(zhì)表達水平的變化，并與SVM等生物信息學相結(jié)合，也篩選出血清淀粉樣蛋白，聯(lián)合篩選出的其他四種蛋白質(zhì)Bel-2 家族細胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白、WAP二硫化四物核心蛋白、Krueppel樣因子8、單核細胞趨化蛋白可作為生物標志物，預(yù)測腎透明細胞癌的靈敏度為 87.5%（35/40）， 特異度為86.8%（46/53），雖然SAA不是腎癌的特異標志物，但根據(jù)其一些規(guī)律的變化，如活動期的急劇增加，或者治療后的降低等，配合血清學檢測方法的高靈敏度，我們認為SAA極有可能成為腎癌的血清分子生物標志物，這對早期腎癌的研究、診斷產(chǎn)生重要臨床價值。

1.3 胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorvlase，TP）

胸苷磷酸化酶是由兩條多肽鏈構(gòu)成的二聚體，它是近年來發(fā)現(xiàn)的一種細胞生長因子，在密啶核苷代謝中起重要作用，是嘧啶核苷合成及分解過程中的重要酶，它還能促進血管生成，是促腫瘤微血管生長因子之一。Unwin等[5]應(yīng)用血清蛋白質(zhì)組分析技術(shù)在腎透明細胞癌患者血清中發(fā)現(xiàn)TP在所有的腎癌組織中表達上調(diào)，但在正常腎上皮組織中不表達或表達量很低調(diào)，經(jīng)進一步分析發(fā)現(xiàn)，認為TP可作為腎癌診斷的特異性的分子。到目前為止，還沒有大量的研究證實TP是腎癌的生物標識，但很多研究人員發(fā)現(xiàn)在癌組織中的TP表達顯著高于癌旁正常組織。胃癌﹑結(jié)直腸癌﹑乳腺癌癌組織中TP表達陽性率分別為64.89%，69.31%、81.18%，因此，仍可將TP 可作為一種腫瘤標志物進行監(jiān)測[6]。

1.4 結(jié)合珠蛋白 （haptoglo-bin，Hp）

結(jié)合珠蛋白又稱觸珠蛋白，是一種α2 球蛋白，也是酸性糖蛋白，人類的血清及其他體液中廣泛存在。主要作用是結(jié)合游離的血紅素，防止鐵和血紅蛋白從腎臟中流失，避免對腎臟造成損害。它還是一種急性期時相反應(yīng)蛋白，當機體處在應(yīng)激狀態(tài)時，血液中的結(jié)合珠蛋白明顯增加，因此認為，對結(jié)合珠蛋白含量的動態(tài)監(jiān)測，有益于疾病的診斷和輔助治療。Zhang Q[7-9]等篩查腎母細胞瘤患兒血清中的生物標志物時聯(lián)用SELDI-TOF-MS、HPLC、2D-LC-LTQ-MS等技術(shù)， 發(fā)現(xiàn)了可作為兒童腎母細胞瘤中特定的標志蛋白之一就是結(jié)合珠蛋白，它們在兒童早期腎母細胞瘤中表達均偏高。最近有報道通過蛋白質(zhì)組學技術(shù)在腎透明細胞癌早期階段的血清中又有新的發(fā)現(xiàn)，結(jié)合珠蛋白的多態(tài)性還與鐵的代謝平衡相關(guān)。近幾年，許多研究者發(fā)現(xiàn)，結(jié)合珠蛋白在其他腫瘤如肺癌、卵巢癌中存在高表達現(xiàn)象，并且與他們疾病的進展程度相關(guān)。王冰，朱月蓉等[10]研究性宮頸癌患者與健康者血清時，也發(fā)現(xiàn)宮頸癌早期血清含量Hp明顯增高，因此，可認為結(jié)合珠蛋白可作為惡性腫瘤生物標志物進行觀察，但若作為腎癌臨床診斷的依據(jù)，仍需根據(jù)Hp的表型，并聯(lián)合其他腫瘤生物標志物，進行腎癌的診斷和鑒別。

2 應(yīng)用于腎癌發(fā)展、分期、治療及預(yù)后的生物標志物

2.1 S100家族蛋白（S 100 proteins）

S100家族蛋白是鈣離子結(jié)合蛋白，是具有EF-手型基序超家族，成員達20多個，相對分子質(zhì)量較小，在10-12 kD，空間結(jié)構(gòu)較特殊，可以與鈣離子產(chǎn)生特異性結(jié)合，S100蛋白參與細胞內(nèi)的增殖、分化、凋亡等多種生物學功能[11]。許多研究發(fā)現(xiàn)S100與腎癌進展密切相關(guān)，因此而成為研究的熱點，它在腎癌的發(fā)生、發(fā)展、治療、耐藥等過程中均發(fā)揮重要的生物學活性和作用。Geissler K等[12]深入研究發(fā)現(xiàn)早期腎癌與良性腎臟病變患者、其他泌尿系腫瘤或非癌癥患者以及非正常對照組相比較，含有27種獨特表達的蛋白質(zhì)，其中就有鈣離子結(jié)合蛋白，他們大多數(shù)可以與腎透明細胞癌免疫反應(yīng)失調(diào)有關(guān)，可用于診斷腎透明細胞癌。Zhang 等[13]通過免疫組化驗證證實小型鈣離子結(jié)合蛋白 S100 家族 S100A8 和 S100A9 是潛在的生物標志物，可用于診斷腎癌和作為潛在的治療靶點。進一步研究發(fā)現(xiàn)，不同腫瘤T分期的RCC患者血清中， S100A8和S100A9表達的變化隨著腎癌的 TNM分期升高，S100A8和S100A9蛋白在腎癌中的表達水平顯著上升，在Zhang L等[14]的研究中發(fā)現(xiàn)也是如此。Gabril M 等[15]研究發(fā)現(xiàn)在腎癌中，隨著腫瘤分級和分期升高，S100A11在腎癌組織中的表達顯著上調(diào)，與S100A11低表達的腎癌患者相比，S100A11高表達的患者的預(yù)后更差。說明S100A11 還與腎癌的臨床分期和預(yù)后有關(guān)。故可認為隨著對S100家族與腎癌的研究不斷深入，S100家族有望為腎癌治療提供新的診斷、治療、預(yù)后分子生物標志物。

2.2 熱休克蛋白（heatshockprotein，HSP）

熱休克蛋白是一類進化上高度保守的蛋白質(zhì)，是蛋白質(zhì)分子的分子伴侶，它主要有HSP60、HSP70、HSPI10、HSP90和小分子量HSPs等5個家族。HSP70、HSP90在細胞中含量較廣泛且較多，在生理或病理過程中發(fā)揮重要作用，在正常情況下，他們的表達受細胞周期調(diào)控，但在高熱、惡性腫瘤等狀況下，熱休克蛋白表達量增高，zhang Y等[16]應(yīng)用iTRAQ標記和LC-MS/MS技術(shù)分析腎癌患者和非癌癥患者血液樣本時，發(fā)現(xiàn)差異血清蛋白中上調(diào)的就有熱休克蛋白70家族的成員HSC71，熱休克蛋白在其他腫瘤中也有過表達，有研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中HSP70表達與癌細胞的增殖，分化、分級等相關(guān)，還有研究提示食管癌轉(zhuǎn)移與HSP70有關(guān)，是一個重要的預(yù)后指標。是癌細胞增生的標志，F(xiàn)U等[17]應(yīng)用蛋白質(zhì)組技術(shù)研究表明，HSP90a診斷肝癌的敏感度和特異度分別為92.7%、91.3%，此外，HSP90a在肝癌組織中的表達與臨床分期、病理分級、療效監(jiān)測密切相關(guān)?？梢?，HSP70和HSP90與多種腫瘤的演進有關(guān)，雖然直至目前，還沒有足夠的研究證實HSP70和HSP90可作為腎癌分期分級的特異生物分子標志物，但不能否認HSP70和HSP90作為腫瘤生物分子標志物對腎癌患者病情進展的監(jiān)測、療效監(jiān)測等所產(chǎn)生的重要臨床意義。

3 討論

腫瘤生物分子標志物，可以預(yù)測個人患腫瘤的風險和早期篩查是否患腫瘤;也可以監(jiān)測腫瘤發(fā)展進程、是否復(fù)發(fā)、或某類藥物治療的敏感性。綜上所述，有不少的學者采用蛋白質(zhì)組技術(shù)對腎癌蛋白生物分子標志物進行研究，發(fā)現(xiàn)了一些特異性的腎癌標志物可作為早期診斷的候選指標;鑒定了若干跟腎癌發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移治療相關(guān)的蛋白質(zhì)等，但受限于蛋白質(zhì)組技術(shù)還存在的一些問題，如應(yīng)用2-DE技術(shù)對低豐度蛋白的分辨率較差，可重復(fù)性不夠等，發(fā)現(xiàn)和鑒定的腎癌標志物特異性不夠好，敏感度較低，應(yīng)用于作為腎癌早期診斷、療效評價、預(yù)后判斷及其藥物篩選研究也不夠多，至今，F(xiàn)DA 尚未批準可用于腎癌臨床診斷的體液生物標志物。因此，進一步提高蛋白質(zhì)組學技術(shù)及其他相關(guān)腫瘤標志物篩選鑒定技術(shù)，在探索并篩選出最佳腎癌生物分子標志物或可能的分子標志物組合的同時，對已發(fā)現(xiàn)的腎癌生物分子標志物的功能和臨床價值進行進一步研究，并應(yīng)用于診斷、療效評價、藥物篩選仍有巨大潛力和研究空間。

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基金項目：湖南省高等學?？茖W研究項目（項目編號：10C0264）

作者簡介：喻小燕（1973—），女，湖南寧鄉(xiāng)人，碩士，主要從事蛋白質(zhì)化學與蛋白質(zhì)組學研究。