鰲肢動(dòng)物Wnt基因家族的全基因組與進(jìn)化分析

梁 園,周 雁,2*

1.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200438

2.中國(guó)國(guó)家人類(lèi)基因組中心上海市疾病與健康基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201203

Wnt基因編碼了一類(lèi)分泌性的糖蛋白配體，長(zhǎng)度通常在350 到400 個(gè)氨基酸之間，以具有23～24個(gè)保守的半胱氨酸為特征[1-4]。Wnt分子激發(fā)的信號(hào)通路參與了多種生物過(guò)程的調(diào)節(jié)，在生物體的發(fā)育過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，包括細(xì)胞形態(tài)的分化、體細(xì)胞形態(tài)和功能穩(wěn)態(tài)的維持、胚軸形成，組織的再生和免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)[5,6]。

Wnt基因家族的起源非常古老，且具有多樣性。利用已有的基因組信息對(duì)Wnt基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，在刺胞動(dòng)物和兩側(cè)對(duì)稱(chēng)動(dòng)物的共同祖先中可能存在13 個(gè)Wnt亞家族[7,8]。其中，在腔腸動(dòng)物門(mén)的?？∟ematostella vectensis）中發(fā)現(xiàn)了12 個(gè)Wnt 亞家族[9]。此外，在哺乳動(dòng)物中還發(fā)現(xiàn)了Wnt基因的擴(kuò)增現(xiàn)象，例如在人類(lèi)的基因組中共鑒定出了19 個(gè)Wnt基因，包括了12 個(gè)Wnt亞家族[10]。然而，在節(jié)肢動(dòng)物中，Wnt基因的數(shù)量存在著物種間的差異。在昆蟲(chóng)類(lèi)的果蠅和蜜蜂的基因組中分別發(fā)現(xiàn)了7 個(gè)Wnt基因亞家族[11]，然而在甲殼綱動(dòng)物蚤狀溞（Daphnia pulex）中則鑒定出了12 個(gè)Wnt基因亞家族[12]。另外，根據(jù)Wnt基因在基因組上分布的位置關(guān)系，研究者發(fā)現(xiàn)Wnt基因在基因組上存在一定程度的連鎖分布現(xiàn)象，形成了具有共線性的基因簇。在刺胞動(dòng)物和兩側(cè)對(duì)稱(chēng)動(dòng)物的共同祖先中可能有2 個(gè)具有共線性的Wnt基因簇，其中一個(gè)基因簇由Wnt9，-1，-6 和-10連鎖分布形成，另一個(gè)由Wnt5和Wnt7組成的另一個(gè)基因簇，但目前尚不清楚在節(jié)肢動(dòng)物中是否仍然存在這一基因簇[7,11,13]。

迄今為止，在節(jié)肢動(dòng)物門(mén)的螯肢動(dòng)物中，仍然缺乏關(guān)于Wnt基因的全基因組的分析研究。不過(guò)，近期發(fā)表的拼接質(zhì)量較高的螯肢動(dòng)物的基因組數(shù)據(jù)為全面研究螯肢動(dòng)物中的Wnt基因的特征提供了資源。在本研究中，我們采用生物信息學(xué)方法對(duì)螯肢動(dòng)物的Wnt基因序列進(jìn)行了鑒定和分析，并進(jìn)一步比較了其數(shù)量、結(jié)構(gòu)、基因組分布和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，以期為Wnt基因家族在節(jié)肢動(dòng)物乃至后生動(dòng)物中的和進(jìn)化過(guò)程和功能的進(jìn)一步研究提供有力的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 螯肢動(dòng)物基因組序列獲取

我們收集了公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)中的7 種螯肢動(dòng)物的基因組和1 種的轉(zhuǎn)錄組，包括蝎子類(lèi)（Centurouroides sculpturatus），蜘蛛類(lèi)（Parasteatoda tepidariorum），蜱螨類(lèi)（Tetranychus urticae,Dinothrombium tinctorium，Ixodes scapularis），鱟類(lèi)（Limulus polyphemus，Tachypleus tridentatus）和海蜘蛛類(lèi)（Pycnogonumsp.）。所收集的7 種螯肢動(dòng)物的基因組都拼接到了scaffold 或染色體水平。海蜘蛛Pycnogonumsp.的原始RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)從NCBI SRA 數(shù)據(jù)庫(kù)下載得到，檢索號(hào)為SRR8745912。

1.2 螯肢動(dòng)物Wnt 基因家族的核酸序列和氨基酸序列的獲取

利用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中代表性的節(jié)肢動(dòng)物的Wnt基因的氨基酸序列為搜索序列，來(lái)搜索螯肢動(dòng)物基因組和轉(zhuǎn)錄組中的的Wnt基因家族成員[11,14,15]，首先使用BlastP 和TBlastN 算法[16]搜索螯肢動(dòng)物預(yù)測(cè)基因的蛋白序列和基因組序列，e 值閾值選擇10-5。然后將獲得的序列與Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，檢測(cè)是否存在Wnt 保守結(jié)構(gòu)域。接下來(lái)使用PF00110 這一Wnt 保守結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫文件，利用HMMER 程序包[17]的HMMsearch 程序在螯肢動(dòng)物的預(yù)測(cè)基因中搜索是否存在其它Wnt基因。第三，使用Clustal W[18]對(duì)每個(gè)物種已搜索到的Wnt基因進(jìn)行聚類(lèi)，使用HMMbuild 程序構(gòu)建物種特異的Wnt 隱馬爾可夫文件，然后再一次用HMMsearch 對(duì)螯肢動(dòng)物的預(yù)測(cè)基因進(jìn)行搜索，以獲得物種特異的Wnt基因家族候選序列。鑒定得到的Wnt 蛋白序列在SMART 中進(jìn)行比對(duì)，以鑒定信號(hào)肽和其它保守結(jié)構(gòu)。鑒定出的Wnt 蛋白結(jié)構(gòu)域使用IBS 1.0.3 軟件繪制[19]。

1.3 Wnt 蛋白多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析

選擇鑒定得到的2 種鱟、1 種蝎子、1 種蜘蛛、1 種螨蟲(chóng)、1 種蜱蟲(chóng)、1 種海蜘蛛，以及已知的1種蜜蜂、1 種甲蟲(chóng)、1 種蚜蟲(chóng)、1 種蜈蚣、1 種水蚤和1 種家鼠的Wnt基因用于進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。首先用Clustal W[18]的BLOSUM 打分矩陣進(jìn)行多序列比對(duì)，然后使用PhyML 3.0[20]采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，使用SH-aLRT 方法對(duì)分支的支持度進(jìn)行評(píng)估。

2 結(jié)果與分析

2.1 螯肢動(dòng)物Wnt 基因家族的鑒定

我們?cè)? 種螯肢動(dòng)物中共鑒定得到87 個(gè)Wnt基因家族成員。其中，在中華鱟和美洲鱟中分別發(fā)現(xiàn)了15 個(gè)和18 個(gè)Wnt基因，在蝎子中發(fā)現(xiàn)了13 個(gè)Wnt基因，在蜘蛛中發(fā)現(xiàn)了12 個(gè)Wnt基因，在二斑葉螨、肩突硬蜱和天鵝絨螨蟲(chóng)中分別鑒定到了8、7、6 個(gè)Wnt基因，在海蜘蛛中發(fā)現(xiàn)了8 個(gè)Wnt基因。每個(gè)基因都在之后的系統(tǒng)發(fā)育分析中進(jìn)一步進(jìn)行了亞家族分類(lèi)。在蝎子，蜘蛛和海蜘蛛中，鑒定到的Wnt基因的氨基酸序列均由300 至400 個(gè)氨基酸構(gòu)成。在二斑葉螨、肩突硬蜱、和天鵝絨螨蟲(chóng)中，大多數(shù)鑒定得到的Wnt基因的氨基酸序列長(zhǎng)度在300 至400 之間，除了在每個(gè)物種中分別鑒定出了各2 個(gè)相對(duì)較短的Wnt 氨基酸序列以及一個(gè)較長(zhǎng)的Wnt16 序列。在中華鱟和美洲鱟的基因組中，Wnt 氨基酸序列的長(zhǎng)度出現(xiàn)了更高的變異度，包含了兩條較長(zhǎng)的TtWnt1 和TtWnt5c 以及若干較短的Wnt 蛋白序列。

2.2 螯肢動(dòng)物的Wnt 基因氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域分析

進(jìn)一步對(duì)螯肢動(dòng)物的Wnt基因的氨基酸序列特征和結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在包括鱟、蝎子、蜘蛛和海蜘蛛在內(nèi)的物種中的Wnt 氨基酸序列都含有高度保守的Wnt 結(jié)構(gòu)域（見(jiàn)圖1a），位于序列的C 末端附近，在這些Wnt 氨基酸序列的N 末端還發(fā)現(xiàn)了多種結(jié)構(gòu)序列，包括長(zhǎng)度為20～30個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列、跨膜區(qū)序列或低復(fù)雜度區(qū)域。然而在3 個(gè)蜱螨類(lèi)物種中鑒定到的一部分Wnt基因的氨基酸序列的N 末端則缺少了這些結(jié)構(gòu)域（見(jiàn)圖1b）。此外，我們對(duì)在蝎子、蜘蛛和海蜘蛛中鑒定到的長(zhǎng)度在300 至400 aa 之間的Wnt基因的氨基酸序列做了多序列比對(duì)，結(jié)果顯示這些序列中存在21 個(gè)保守的半胱氨酸殘基，呈分散分布于序列當(dāng)中，這與在其它后生生物中鑒定到的Wnt基因家族的氨基酸序列的特征是一致的，這些半胱氨酸殘基可能有助于這些Wnt 蛋白質(zhì)的正確折疊。

圖1 螯肢動(dòng)物Wnt 基因結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of Wnt gene in Chelicerata

2.3 螯肢動(dòng)物的Wnt 基因在基因組上的連鎖分布

為了進(jìn)一步探索螯肢動(dòng)物Wnt基因的進(jìn)化現(xiàn)象，我們比較了其中6 個(gè)物種的Wnt基因在基因組上的分布（見(jiàn)圖2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了美洲鱟以外，其它螯肢動(dòng)物都保留了進(jìn)化上保守的基因簇Wnt9-Wnt1-Wnt6-Wnt10中的一部分，各自伴隨著譜系特異性重排或丟失現(xiàn)象。中華鱟基因組中的Wnt6和Wnt1基因位于其3 號(hào)染色體上，蝎子和蜘蛛基因組中的Wnt6和Wnt1基因分別位于各一條scaffold 上。此外，在蝎子的另一條scaffold 上還發(fā)現(xiàn)了Wnt9-Wnt6-Wnt1的連鎖分布，在肩突硬蜱的基因組中的一條scaffold 上發(fā)現(xiàn)了相鄰的Wnt9-Wnt1基因簇。有趣的是，我們?cè)谥腥A鱟、美洲鱟、蝎子和蜘蛛的基因組中還發(fā)現(xiàn)了Wnt5和Wnt7基因簇，分別位于中華鱟的2 條染色體上和美洲鱟的3 條scaffolds 上。除此之外，我們還發(fā)現(xiàn)了除了這兩個(gè)基因簇以外的新的Wnt基因簇。在美洲鱟基因組中，有一串相鄰分布的Wnt11-Wnt7基因簇，位于1 條scaffold 上。在蝎子中，發(fā)現(xiàn)了相鄰分布的的Wnt2和Wnt16基因簇。在蜘蛛基因組中，Wnt4和Wnt11被發(fā)現(xiàn)相鄰分布于1 條scaffold 上。

圖2 螯肢動(dòng)物Wnt 基因的連鎖分布Fig.2 The conserved Wnt gene cluster in six chelicerates and four other arthropods

2.4 螯肢動(dòng)物Wnt 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建及分析

為了進(jìn)一步闡明螯肢動(dòng)物的Wnt基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，我們利用7 個(gè)螯肢動(dòng)物以及其它節(jié)肢動(dòng)物（包括蜈蚣、水蚤、蜜蜂、蚜蟲(chóng)、以及甲蟲(chóng)）的Wnt基因的氨基酸序列，采用最大似然法構(gòu)建了Wnt基因家族的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，采用小鼠的Wnt3基因序列作為外類(lèi)群。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，螯肢動(dòng)物的Wnt家族可分為11 個(gè)不同的亞家族（見(jiàn)圖3）。如在其它節(jié)肢動(dòng)物中所發(fā)現(xiàn)的，這些螯肢動(dòng)物的基因組發(fā)生了Wnt3亞家族的缺失。有趣的是，螯肢動(dòng)物的基因組中還另外缺失了Wnt10亞家族。同時(shí)，我們僅在蝎子和肩突硬蜱中鑒定到了Wnt9亞家族序列。與其它類(lèi)節(jié)肢動(dòng)物基因組大多擁有單拷貝的Wnt基因所不同，螯肢動(dòng)物的Wnt5，Wnt7和Wnt11亞家族基因表現(xiàn)出具有多拷貝的擴(kuò)增現(xiàn)象（見(jiàn)圖3），這可能暗示了在螯肢動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程的早期出現(xiàn)了基因組的擴(kuò)增現(xiàn)象。對(duì)于每個(gè)物種而言，在中華鱟、美洲鱟，蝎子和蜘蛛中分別鑒定出9、10、9、10 個(gè)Wnt亞家族。在海蜘蛛基因組中，鑒定到了8 個(gè)Wnt亞家族。值得注意的是，在螨蟲(chóng)和蜱蟲(chóng)中共鑒定出6 個(gè)和7個(gè)Wnt亞家族，與其它螯肢動(dòng)物相比，表現(xiàn)出了Wnt2和Wnt7的丟失現(xiàn)象，這可能與其進(jìn)化速率是有關(guān)的。此外，從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上，我們發(fā)現(xiàn)Wnt1和Wnt6亞家族作為姐妹類(lèi)群聚成一支，且具有分?jǐn)?shù)較高的的支持度，這表明這兩個(gè)亞家族可能是由于串聯(lián)重復(fù)進(jìn)化而來(lái)的。我們還發(fā)現(xiàn)Wnt2，Wnt6，Wnt8和Wnt16亞家族的基因都分為了支持度較高的兩個(gè)分支（螯肢動(dòng)物分支和非螯肢動(dòng)物分支），這表明這些基因亞家族在螯肢動(dòng)物和其它節(jié)肢動(dòng)物之間的進(jìn)化距離更遠(yuǎn)。

圖3 Wnt 基因家族系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig.3 The phylogenetic tree of the Wnt families

3 討論

在本研究中，我們用生物信息學(xué)方法全面鑒定了8 種螯肢動(dòng)物的Wnt基因家族，這可以為進(jìn)一步理解Wnt基因在后生動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程中的進(jìn)化模式提供基礎(chǔ)。盡管在基因組的測(cè)序和拼接過(guò)程中會(huì)有一定的錯(cuò)誤，但是這8 個(gè)高深度、高覆蓋度、高拼接水平的基因組和轉(zhuǎn)錄組資源為我們提供了從全基因組和轉(zhuǎn)錄組水平鑒定Wnt基因的條件。從結(jié)構(gòu)分析結(jié)果來(lái)看，在蝎子、蜘蛛和海蜘蛛中，大多數(shù)Wnt 氨基酸序列都包含可識(shí)別的信號(hào)肽區(qū)域，而其它物種中的一些Wnt序列則顯然缺乏該基序。考慮到信號(hào)肽的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)算法仍是有限的，這些序列仍然有包含現(xiàn)有預(yù)測(cè)軟件無(wú)法識(shí)別的信號(hào)肽的可能性，需要進(jìn)一步的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定這些缺乏信號(hào)肽的序列是否為非分泌型Wnt 蛋白。從基因組的分布情況來(lái)看，在蝎子中我們發(fā)現(xiàn)了2 個(gè)位于不同scaffold 上的Wnt6-Wnt1簇，同時(shí)分別在兩種鱟的不同scaffold 和染色體上的發(fā)現(xiàn)了2 個(gè)和3 個(gè)Wnt5-Wnt7簇，這可能暗示了在鱟的祖先中曾發(fā)生了全基因組復(fù)制事件。從系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果來(lái)看，螯肢動(dòng)物的Wnt基因家族包括了11 個(gè)亞家族，丟失了Wnt3和Wnt10亞家族，這表明螯肢動(dòng)物的共同祖先可能已缺失了這兩個(gè)亞家族。其它亞家族的丟失是在螯肢動(dòng)物的進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生的。此外，在螨蟲(chóng)和蜱蟲(chóng)中鑒定出了數(shù)量較少的6 個(gè)和7 個(gè)Wnt亞家族，這可能是因?yàn)樗鼈冊(cè)谡麄€(gè)進(jìn)化過(guò)程中具有更快的進(jìn)化速度從而導(dǎo)致了大量的Wnt基因丟失。相反，Wnt5，Wnt7和Wnt11亞家族在鱟和蝎子中具有多個(gè)基因的拷貝，表現(xiàn)出了較大程度的擴(kuò)張，而在其它節(jié)肢動(dòng)物（如昆蟲(chóng)和甲殼類(lèi)動(dòng)物）中則表現(xiàn)為單拷貝。對(duì)這些螯肢動(dòng)物中擴(kuò)張的Wnt亞家族的具體功能研究正在進(jìn)行當(dāng)中。

4 結(jié)論

在本研究中，我們對(duì)螯肢動(dòng)物中的Wnt基因家族做了全基因組的生物信息學(xué)鑒定和分析，從螯肢動(dòng)物的8 個(gè)物種中共鑒定出了87 個(gè)Wnt基因。我們進(jìn)一步分析了這些Wnt基因的基因結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)這些基因包含高度保守的Wnt結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽、跨膜區(qū)域或低復(fù)雜度區(qū)域。對(duì)這些Wnt基因在基因組上的分布研究發(fā)現(xiàn)，在螯肢動(dòng)物中的Wnt基因簇主要存在兩種連鎖分布模式（Wnt9-Wnt6-Wnt1或Wn5-Wnt7），并且還有一些譜系特異性的基因簇。螯肢動(dòng)物中的Wnt基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示了Wnt5、Wnt7和Wnt11的擴(kuò)張以及Wnt3和Wnt10的缺失，這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究螯肢動(dòng)物中的Wnt基因家族的功能提供了基礎(chǔ)。