芙蓉李咀嚼片酚類(lèi)物組成及其生物活性

湯葆莎，賴(lài)譜富，李怡彬，吳 俐，翁敏劼，鄭恒光

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福建 福州 350003；2.福建省農(nóng)產(chǎn)品（食品）加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350003）

0 引言

【研究意義】芙蓉李是福建李果產(chǎn)業(yè)的主栽品種，也是主要的李果加工品種（占95%以上），在永泰、福安、屏南、永安等地均有大面積種植，單永泰一縣的種植面積就達(dá)9133.33 hm2[1]。芙蓉李成熟期主要集中在6～7 月，采摘周期短，且易腐、不易較長(zhǎng)時(shí)間保藏，主要被加工成李干、蜜餞類(lèi)產(chǎn)品，造成芙蓉李加工產(chǎn)業(yè)存在產(chǎn)品單一、產(chǎn)品附加值低、經(jīng)常供過(guò)于求等困境，影響產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展[1]。鑒于芙蓉李果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，含有蛋白質(zhì)、可溶性糖、有機(jī)酸（主要為蘋(píng)果酸[2-3]）等，特別是含有花色苷等酚類(lèi)活性物質(zhì)[4-5]，利用芙蓉李果實(shí)中的多酚物質(zhì)開(kāi)發(fā)咀嚼片類(lèi)功能食品潛力大，開(kāi)展芙蓉李咀嚼片酚類(lèi)物質(zhì)及其生物活性研究可為產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供依據(jù)，賦予產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)健康新概念?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】前人對(duì)紅棗藕節(jié)[6]、五味子[7]、藍(lán)莓復(fù)方[8]、即食型復(fù)方黃精[9]和麥麩膳食纖維[10]咀嚼片的抗氧化能力進(jìn)行研究，得出各種咀嚼片均有提高機(jī)體抗氧化能力的作用。芙蓉李屬于高多酚含量的李果品種，果實(shí)中兒茶素的含量高達(dá)295.89 mg·kg-1[11]，而植物多酚是一類(lèi)廣泛存在于植物體內(nèi)的抗氧化劑，有抗氧化、預(yù)防癌癥和心血管疾病、抑菌消炎和抗病毒等作用，是一種具有獨(dú)特生理活性和藥理活性的次生代謝天然產(chǎn)物[12-14]。同時(shí)，也有學(xué)者對(duì)蔬菜醇提物[15]、谷物雜糧醇提物[16]和幾種天然產(chǎn)物[17]等物質(zhì)對(duì)黃嘌呤氧化酶XOD 的抑制性進(jìn)行了研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】筆者前期研究已發(fā)現(xiàn)芙蓉李多酚提取物具有抗氧化和抑制黃嘌呤氧化酶XOD 活性的作用[18]。但目前尚未有針對(duì)芙蓉李加工產(chǎn)品酚類(lèi)物質(zhì)組分及含量和生物活性的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以選定的芙蓉李加工產(chǎn)品咀嚼片為樣本，分析產(chǎn)品酚類(lèi)物質(zhì)組分及含量，探討其體外抗氧化和輔助降尿酸的能力，以期為芙蓉李加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

芙蓉李果粉制備：芙蓉李果經(jīng)清洗、去核、切片后，采用熱泵干燥機(jī)60 ℃干燥、粉碎而成。

芙蓉李多酚粉制備：取芙蓉李果粉，利用超聲波輔助乙醇提取（60%乙醇、超聲時(shí)間30 min、提取溫度50 ℃）后，減壓濃縮（-0.098 MPa，50 ℃）去乙醇，并將芙蓉李多酚溶液濃縮至17%，4 ℃冰箱冷藏保存?zhèn)溆茫焕脟婌F干燥法制備芙蓉李多酚粉，選用麥芽糊精∶β-環(huán)糊精∶阿拉伯膠=7∶2∶1 作為壁材，噴霧干燥參數(shù)：芯材壁材比為1∶4，進(jìn)風(fēng)溫度為130 ℃，進(jìn)料固形物含量為15%，進(jìn)料流量300 mL·h-1；制備的芙蓉李多酚粉呈紫紅色。

麥麩菌粉制備[10]：以面粉廠直接購(gòu)置的麥麩為發(fā)酵基質(zhì)、食用菌秀珍菇（Pleurotus geesteranus）-XJ為發(fā)酵菌株，采用固液多級(jí)優(yōu)化培養(yǎng)方式獲得秀珍菇液體菌種，麥麩基質(zhì)固體培養(yǎng)的最終含水量為120%（其中接種量為30%），于培養(yǎng)箱中27 ℃遮光培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)基質(zhì)，之后50～60 ℃熱風(fēng)烘干至恒重，再粉碎至100～200 目而制得麥麩菌粉（其膳食纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)40.14%）。

阿拉伯膠（食品級(jí)）：上海權(quán)旺生物科技有限公司；麥芽糊精（食品級(jí)）：DE=12，石家莊華辰淀粉糖生產(chǎn)有限公司；β-環(huán)糊精（食品級(jí)）：江蘇豐園生物技術(shù)有限公司；微晶纖維素等其他輔料皆為食品級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

SY6000 小型噴霧干燥儀（上海世遠(yuǎn)生物設(shè)備工程有限公司）、KQ-600DV 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超生儀器有限公司）、765P 紫外分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）、CJY-300C 型智能片劑脆碎度測(cè)定儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）、YPD-300D 型片劑硬度儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）、ZB-1G 型智能崩解儀（天津海益達(dá)科技有限公司）、ZP9A 型旋轉(zhuǎn)式壓片機(jī)（上海天凡藥機(jī)制造廠）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 芙蓉李咀嚼片制備工藝流程[10，19-20]芙蓉李咀嚼片制備工藝流程如下：原料→混合→攪拌均勻→壓片→質(zhì)量檢驗(yàn)→包裝→成品。

前期項(xiàng)目組對(duì)芙蓉李咀嚼片配方已做了大量的篩選試驗(yàn)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，芙蓉李果粉和芙蓉李多酚粉由于易受潮，直接壓片制成咀嚼片太僵硬，不好咀嚼，且原料的流動(dòng)性差。為改善原料的流動(dòng)性，提高咀嚼片的質(zhì)量，須在添加15%～20%麥麩菌粉、10%微晶纖維素、5%～10%麥芽糊精的條件下，才能使制作咀嚼片的粉末原料的流動(dòng)性、可壓性和潤(rùn)滑性達(dá)到片劑制備的要求。本試驗(yàn)只將與酚類(lèi)物質(zhì)相關(guān)的芙蓉李咀嚼片配方納入研究中，制作芙蓉李咀嚼片的步驟為：首先按配方將所需的每種原料和輔料粉稱(chēng)量好；其次按1∶1 比例、以從少到多的順序進(jìn)行粉料的混合，分批次混合完畢后再混合均勻；然后將混合均勻的粉末放入高速旋轉(zhuǎn)式壓片機(jī)中壓片，制成成品。

1.3.2 片質(zhì)量、崩解時(shí)限、硬度及脆碎度測(cè)定[10，19-20]片質(zhì)量測(cè)定：取樣品20 片，分別精密稱(chēng)定，計(jì)算平均片質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)差。

崩解時(shí)限測(cè)定：取樣品3 片，分別置于智能崩解儀的吊籃玻璃管中，每管各放一分散后記錄每片崩解的時(shí)間，取平均值為其崩解時(shí)限。

硬度測(cè)定：取6 片芙蓉李咀嚼片，在片劑硬度儀上分別對(duì)片劑硬度進(jìn)行測(cè)定，以其平均值為最終片劑硬度指標(biāo)。

脆碎度測(cè)定：取10 片芙蓉李咀嚼片，用風(fēng)機(jī)吹去其外表粉末，稱(chēng)取質(zhì)量后，放置于脆碎度測(cè)定儀中轉(zhuǎn)動(dòng)100 次，取出后再用同法除去外表粉末，稱(chēng)取其質(zhì)量，計(jì)算出脆碎度。

1.3.3 芙蓉李咀嚼片提取液制備 將芙蓉李咀嚼片搗碎，按料液比[咀嚼片物料質(zhì)量（g）∶乙醇溶液體積（mL）]1∶30 的比例，在帶塞的三角瓶中加入咀嚼片和60%乙醇（V / V），以提取時(shí)間60 min、功率420 W、溫度50 ℃的參數(shù)為條件，于超聲波清洗器中進(jìn)行提取，之后將提取液抽濾、濃縮至無(wú)醇味后，制備得到咀嚼片提取液，密封，置于4 ℃冰箱備用。咀嚼片提取液用于測(cè)定多酚含量、清除DPPH自由基和羥自由基能力及XOD 抑制活性，以固形物含量標(biāo)定其濃度。

1.3.4 總多酚及總黃酮含量測(cè)定[21-22]以沒(méi)食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用Foin-Ciocaheu 法測(cè)定總多酚含量。取200 μL 樣品，加入2.5 mL 10%（V / V）福林酚溶液，搖勻后，在室溫下遮光放置2 min，再加入2 mL質(zhì)量濃度為75 g·L-1的Na2CO3溶液，混勻，用蒸餾水定容后，于50 ℃水浴鍋中水浴15 min，快速冷卻至室溫，以相應(yīng)試劑為空白，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)765 nm處檢測(cè)吸光度值?？偠喾淤|(zhì)量濃度以每毫升樣液中所含的沒(méi)食子酸當(dāng)量（mg·mL-1）表示。

采用硝酸鋁比色法測(cè)定芙蓉李咀嚼片中總黃酮含量。

1.3.5 酚類(lèi)物質(zhì)測(cè)定[23]采用高效液相色譜法測(cè)定。色譜條件：C18色譜柱，4.6 mm×250 mm，粒徑5 μm；流動(dòng)相：A 為2%甲酸溶液，B 為乙腈，用前過(guò)0.45 μm 濾膜脫氣；柱溫：40 ℃；流速：0.8 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：280、320、360 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.6 清除DPPH 自由基能力測(cè)定[18]將溶解于甲醇中 的5 mL 100 μmol·L-1DPPH 添 加 到1 mL 提 取 物中，再將其重新懸浮于蒸餾水中?；旌暇鶆蚝?，將混合物靜置暗中25 ℃放置30 min。使用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定吸光度，以未添加DPPH 溶液的樣品為空白對(duì)照。按以下公式計(jì)算清除DPPH 自由基的能力：

抗氧化能力（抑制率，%）= [（Ac－As）/Ac]×100，其中Ac是對(duì)照品（不含DPPH 溶液樣品）的吸光度值；As是測(cè)試樣品的吸光度值。

1.3.7 清除羥自由基能力的測(cè)定[18，24]取1.0 mL 的0.15 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.4）、2 mL 的 0.52 mg·mL-1番 紅 溶 液、1.0 mL 的6 mmol·L-1EDTA-Na2-Fe2＋和0.5 mL 的樣液，混合搖勻后加入0.8 mL 的0.3% H2O2，立即置于40 ℃水浴鍋中水浴30 min，空白組用等體積的超純水代替樣品溶液，對(duì)照組為等體積超純水代替樣液和H2O2溶液；之后于分光光度計(jì)波長(zhǎng)520 nm 處測(cè)定吸光度A。清除羥自由基的能力根據(jù)以下公式計(jì)算：

羥自由基清除能力/%=[（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100，其中As、Ab和Ac是測(cè)試樣品、空白組和對(duì)照組的吸光度值。

1.3.8 XOD 抑制活性測(cè)定[22，25]取少量?jī)龈珊蟮亩喾訕悠酚枚谆鶃嗧浚―MSO）溶解，再用0.2 mol·L-1磷酸緩沖鹽溶液稀釋至不同濃度，在酶標(biāo)板中依次加入50 μL 樣品與150 μL 0.4 mmol·L-1的黃嘌呤，35 ℃下保溫5 min，再加入50 μL 0.05 U·mL-1的XOD，搖勻放置25 min 后，用80 μL 1 mol·L-1的HCL 終止反應(yīng)；每個(gè)樣品3 個(gè)平行，以磷酸緩沖鹽溶液作為空白對(duì)照。取反應(yīng)液以超純水稀釋10 倍，用0.25 μm水性膜過(guò)濾后，用高效液相色譜法檢測(cè)尿酸生成量，以250 nm×4.6 mm×5 μm 的 C18柱為色譜柱，其余色譜液相條件為流動(dòng)相：甲醇-0.015 mol·L-1磷酸二氫胺溶液（15∶85）、檢測(cè)波長(zhǎng)295 nm、運(yùn)行時(shí)間10 min、流速0.8 mL·min-1、進(jìn)樣量20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生產(chǎn)配方對(duì)芙蓉李咀嚼片感官品質(zhì)和物理特性的影響

在前期試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)置2 個(gè)與酚類(lèi)物相關(guān)的咀嚼片配方，按1.3.1 的流程制作咀嚼片，考察2 種配方對(duì)芙蓉李咀嚼片感官品質(zhì)和物理特性的影響。從表1 可以看出，原料中增加或減少芙蓉李果粉、減少或增加麥麩菌粉的比例，咀嚼片的片重、脆碎度和崩解時(shí)限無(wú)明顯差異，感官風(fēng)味變化不大，但芙蓉李果粉添加多、麥麩菌粉添加少就會(huì)使產(chǎn)品硬度增大，咀嚼后粘牙程度加劇，這可能是由于芙蓉李果粉含有蔗糖、果糖等糖類(lèi)物質(zhì)，而麥麩菌粉膳食纖維含量較高，可增大原料流動(dòng)性的緣故。

表1 不同配方的各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)Table 1 Testing criteria on ingredients for tablet formulation

色澤是感官評(píng)價(jià)食品品質(zhì)的一個(gè)重要因素，盡管芙蓉李果粉的比例增加，咀嚼片紅綠值a*升高（增加了3.92%）、亮度L*和黃藍(lán)值b*降低，但差異不顯著，2 種咀嚼片均呈紫紅色。綜合咀嚼片物理特性和感官質(zhì)量，選擇配方B 作為本研究檢測(cè)樣本的芙蓉李咀嚼片生產(chǎn)配方。

2.2 芙蓉李咀嚼片酚類(lèi)物質(zhì)分析

根據(jù)上述優(yōu)化配方制備出的芙蓉李咀嚼片，其酚類(lèi)物質(zhì)如表2 所示。咀嚼片中酚類(lèi)物質(zhì)含量達(dá)到0.630 8%，主要以黃酮類(lèi)物質(zhì)為主，占酚類(lèi)物質(zhì)的83.04%；咀嚼片中花色苷含量有4.354 6 mg·hg-1，這可能是咀嚼片呈紫紅色原因。咀嚼片中還含有表兒茶素、原花青素、兒茶素、原花青素B 等酚類(lèi)單體，其中表兒茶素的含量最高（53.423 9 mg·hg-1）、原花青素次之（12.849 mg·hg-1）。

2.3 芙蓉李咀嚼片清除DPPH 自由基能力

DPPH 被廣泛用于定量測(cè)定天然產(chǎn)物和生物活性成分的抗氧化能力，芙蓉李咀嚼片清除DPPH 自由基能力的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。咀嚼片與Vc 清除DPPH自由基能力都是隨著濃度的升高，清除率增大，呈正相關(guān)的量效關(guān)系；而質(zhì)量濃度在0.16 mg·mL-1時(shí)，芙蓉李咀嚼片與Vc 清除DPPH 自由基的能力無(wú)明顯差異。芙蓉李咀嚼片DPPH 自由基清除率的IC50值為0.07 mg·mL-1，接近于Vc 的IC50值0.064 mg·mL-1，表明芙蓉李咀嚼片與Vc 有相同的DPPH 自由基清除能力。

表2 芙蓉李咀嚼片的酚類(lèi)物質(zhì)分析Table 2 Phenols in chewable plum tablets

2.4 芙蓉李咀嚼片清除羥基自由基能力

圖1 芙蓉李咀嚼片的DPPH 自由基清除能力Fig.1 Scavenging ability on DPPH free radicals of chewable plum tablets

羥基自由基是最活潑的活性氧自由基之一，容易與生物分子反應(yīng)，引起組織損傷或細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致機(jī)體的衰老和疾病。由圖2 可知，芙蓉李咀嚼片提取液能有效清除羥基自由基，清除率隨濃度增加而顯著提高（P＜0.05），且呈現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)；當(dāng)兩者質(zhì)量濃度為0.9～1.5 mg·mL-1時(shí)，芙蓉李咀嚼片清除羥基自由基的能力和Vc 相比，有明顯差異；通過(guò)清除率擬合曲線(xiàn)，芙蓉李咀嚼片清除羥基自由基的IC50值為0.79 mg·mL-1，略高于對(duì)照組Vc 的IC50值0.63 mg·mL-1。說(shuō)明芙蓉李咀嚼片具有較強(qiáng)的羥自由基清除活性。這可能是由于芙蓉李咀嚼片含有原花青素（12.849 mg·hg-1）、表兒茶素（53.423 9 mg·hg-1）等酚類(lèi)物質(zhì)。

圖2 芙蓉李咀嚼片的羥基自由基清除能力Fig.2 Scavenging ability on hydroxyl free radicals of chewable plum tablets

2.5 芙蓉李咀嚼片XOD 抑制活性

XOD 是機(jī)體嘌呤代謝主要的催化酶，可催化次黃嘌呤轉(zhuǎn)化為黃嘌呤，進(jìn)而催化發(fā)生氧化產(chǎn)生尿酸；體內(nèi)尿酸濃度過(guò)高將導(dǎo)致高尿酸血癥，進(jìn)而誘發(fā)痛風(fēng)等代謝性疾病，而黃嘌呤氧化酶抑制劑可降低體內(nèi)XOD 的活性，從而減少尿酸生成。芙蓉李咀嚼片的XOD 抑制活性如圖3 所示。隨著濃度的增加，芙蓉李咀嚼片和別嘌呤醇對(duì)XOD 的抑制能力也增加。作為陽(yáng)性對(duì)照，別嘌呤醇在低濃度下對(duì)XOD 顯示出高抑制活性；芙蓉李咀嚼片在20～1 000 μg·mL-1對(duì)XOD 也有一定的抑制作用，400 μg·mL-1的濃度其抑制率達(dá)62.12%。檢測(cè)得出芙蓉李咀嚼片和別嘌呤醇的IC50分別為258.96 μg·mL-1和7.19 μg·mL-1。

圖3 芙蓉李咀嚼片的黃嘌呤氧化酶抑制能力Fig.3 Xanthine oxidase inhibition ability of chewable plum tablets

3 討論與結(jié)論

本研究以芙蓉李及其多酚提取物為主要原料研制出芙蓉李咀嚼片，咀嚼片配方為芙蓉李果粉40%、芙蓉李多酚粉20%、麥麩菌粉20%、微晶纖維素10%、麥芽糊精10%，制成的咀嚼片顏色呈紫紅色，完整光潔，無(wú)裂片分層，邊沿光滑整齊，酸甜可口，硬度適宜，咀嚼性良好。

植物多酚是植物的次生代謝產(chǎn)物，有助于預(yù)防心腦血管和癌癥等疾病的發(fā)生，其抗氧化活性與總酚的含量相關(guān)[26]。有文獻(xiàn)報(bào)道花色苷具有強(qiáng)大的抗氧化和清除自由基的能力，對(duì)人體微循環(huán)有特殊改善的功效，以高效和高生物利用而著稱(chēng)[27]；喻秀娟等[28]也已報(bào)道李子皮原花青素具有較強(qiáng)清除羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH·自由基的能力。本研究顯示芙蓉李咀嚼片中酚類(lèi)物質(zhì)含量達(dá)到0.630 8%，主要以黃酮類(lèi)物質(zhì)為主，含有表兒茶素、原花青素、花色苷等酚類(lèi)單體，這些元素對(duì)抗氧化和清除自由基有一定的作用，芙蓉李咀嚼片清除DPPH 自由基和羥基自由基的IC50值分別為0.07 mg·mL-1和0.79 mg·mL-1，與Vc 相當(dāng)，這與Ma 等[29]發(fā)現(xiàn)酚類(lèi)物質(zhì)含量直接影響提取物的DPPH 清除率的研究一致，表明其有較強(qiáng)的抗氧化能力。Li 等[18]的研究也表明，芙蓉李多酚類(lèi)物質(zhì)能夠直接捕獲活性氧，阻止過(guò)氧化過(guò)程。由此推測(cè)，芙蓉李咀嚼片較好的抗氧化性來(lái)源于其豐富的小分子酚類(lèi)物質(zhì)活性成分。

XOD 是引導(dǎo)尿酸生成的一種重要酶，黃嘌呤氧化酶抑制劑通過(guò)抑制XOD 的活性來(lái)減少黃嘌呤與次黃嘌呤向尿酸鹽的轉(zhuǎn)化，從本質(zhì)上減少尿酸的生成，來(lái)達(dá)到治療痛風(fēng)的目的[28-31]。在臨床上抑制XOD的藥物有別嘌呤醇、非布司他等，這些西藥雖然見(jiàn)效快，但副作用大。如別嘌呤醇用后，病人易引起發(fā)熱、腹痛、腹瀉、過(guò)敏性皮疹、白細(xì)胞及血小板減少，甚至有可能出現(xiàn)肝功能損害等副作用，因而這些降尿酸西藥應(yīng)用受到明顯限制，從植物尋找副作用小的天然降尿酸藥物或食物是目前研究的熱點(diǎn)[18]；有研究表明茶多酚等天然產(chǎn)物可抑制XOD 介導(dǎo)的尿酸產(chǎn)生[30-31]。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然芙蓉李咀嚼片XOD抑制活性低于常規(guī)降尿酸藥物別嘌呤醇，但仍有較強(qiáng)的抑制活性（IC50為258.96 μg·mL-1）。因此，本試驗(yàn)表明芙蓉李咀嚼片具有較好的抗氧化性和黃嘌呤氧化酶抑制活性，為可我國(guó)芙蓉李精深加工產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)，開(kāi)發(fā)為抗氧化功能食品和輔助降尿酸功能食品的潛力大。