救心菜、明月草和銅錢草的總黃酮含量測定與評價*

朱成豪，寧莞權(quán)，曹其義，唐健民，鄒 蓉，韋 霄，韋記青**

(1.廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所，廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點實驗室，廣西桂林 541006；2.百色學院農(nóng)業(yè)與食品工程學院，廣西百色 533000)

0 引言

救心菜Coraldealbatus又名費菜、養(yǎng)心草、養(yǎng)心菜等，是景天科Crassulaceae多年生肉質(zhì)宿根草本植物，其幼苗及嫩葉可食用，滑潤可口，風味獨特，可涼拌、燒湯、熱炒、泡茶等，是一種營養(yǎng)豐富的保健蔬菜[1-4]。明月草Gynuradivaricata(Linn.) DC.又稱白背三七、白子菜，是菊科Compositae菊三七屬Gynura多年生常綠植物，其莖葉可食用，具有降血糖、降血壓、增強人體免疫力、舒張血管、抑制胃酸分泌、抗血栓、抗組胺、防癌變等功效[5-8]。銅錢草Hydrocotylechinensis(Dunn) Craib是傘形科Umbelliferae天胡荽屬HydrocotyleL.植物，其葉可食用，具有清熱解毒，治砂淋、黃疸、肝炎、腎炎、肝火頭痛、火眼、百日咳、祛濕退黃，利尿消腫等作用[9-10]。這3種特色蔬菜均可用于日常飲食，但目前的開發(fā)利用情況卻并不一致。隨著人們生活水平的不斷提高，對自身健康的維護意識也日漸增強，人們越來越重視日常飲食，藥食兼用的特色蔬菜開始受到青睞。藥食兼用蔬菜是指既可當作蔬菜食用又可祛病健身的植物，長期食用能有效防治和控制高血壓、高血脂及心臟病等現(xiàn)代常見疾病[11]。

研究表明，黃酮類物質(zhì)是一種重要的天然有機化合物，能清除生物體內(nèi)自由基，具有良好的抗氧化作用，并且具有抑制酶活性、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎癥、抗過敏、抗糖尿病并發(fā)癥等功能，且無毒無害，對人類的腫瘤、衰老、心血管病等退變性疾病的治療和預防有重要意義[12-13]。相對于酶提取、微波提取、超臨界萃取、酶解法等，超聲波輔助醇溶液提取植物黃酮類物質(zhì)試驗操作簡單快捷，成本低，并且能有效判斷某一種物質(zhì)總含量[14]。為了解明月草和銅錢草是否與救心菜一樣可推廣開發(fā)成理想的食藥兼用型保健菜，本研究采用超聲波輔助醇溶液提取這3種特色蔬菜的總黃酮含量，并據(jù)此對其開發(fā)價值做出評價。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

原料：救心菜、明月草、銅錢草供試品原材料于2019年10月采自廣西植物研究所喀斯特藥用植物園，林下人工種植一年后采集其新鮮嫩葉清洗干凈后烘干、粉碎，過60目篩備用。

試劑：蘆丁標準品(批號：MUST-12040302，中國藥品生物制品檢定所)；蒸餾水；乙醇、Al(NO3)3、NaNO2、NaOH均為分析純試劑，購自桂林卓一生物有限公司。

1.2 儀器與設備

高速冷凍離心機，電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)，DL-720E智能超聲波。

1.3 標準曲線的制作

用分析天平精密稱取真空干燥至恒重的20 mg蘆丁標準品，用無水乙醇溶解配制成0.4 mg/mL對照品溶液[14]。分別取制備好的對照品溶液0.0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL及提取液1 mL，并分別置于25 mL容量瓶中，各加入50%乙醇至10 mL，各加入5%亞硝酸鈉1 mL，混勻，放置6 min；各加10%硝酸鋁溶液1 mL，混勻，放置6 min；分別加入4%氫氧化鈉溶液10 mL，最后加入50%乙醇混勻，定容，得空白液、對照品溶液及樣品供試液；放置15 min后分別在510 nm波長處測定其吸光值[14-15]。以吸光值為縱坐標，總黃酮濃度為橫坐標繪制回歸曲線，回歸方程為y=13.438x+0.0008，R2=0.999 8。

1.4 提取工藝優(yōu)化

1.4.1 超聲波功率

準確稱取樣品粉末0.2 g，按料液比1∶70 (g∶mL)加入40%乙醇14 mL，混勻后在低頻(35 kHz)超聲波頻率及60，180，300，420，540 W超聲波功率條件下，于60℃水浴中提取30 min，然后4 000 r/min離心5 min，過濾得上清液定容至50 mL，按照制備蘆丁標準曲線步驟計算總黃酮含量，選取得率制高點為最佳提取功率。

1.4.2 提取溫度

準確稱取樣品粉末0.2 g，按料液比1∶70 (g∶mL)加入40%乙醇14 mL，混勻后在超聲波功率為300 W，超聲波頻率為低頻(35 kHz)條件下，分別在40，50，60，70，80℃水浴中提取30 min，然后4 000 r/min離心5 min，過濾得上清液定容至50 mL，按照制備蘆丁標準曲線步驟計算總黃酮含量，選取得率制高點為最佳提取溫度。

1.4.3 乙醇濃度

準確稱取樣品粉末0.2 g，按料液比1∶70 (g∶mL)混勻后在超聲波功率為300 W，超聲波頻率為低頻(35 kHz)條件下，分別加入20%、40%、60%、80%、100%乙醇10 mL，然后在60℃水浴中提取30 min，4 000 r/min離心5 min，過濾得上清液定容至50 mL，按照制備蘆丁標準曲線計算總黃酮含量，選取得率制高點為最佳乙醇提取濃度。

1.4.4 料液比

準確稱取樣品粉末0.2 g，分別按料液比1∶50，1∶60，1∶70，1∶80，1∶90 (g∶mL)加入40%乙醇10，12，14，16，18 mL，混勻后在超聲波功率為300 W，超聲波頻率為低頻(35 kHz)，60℃水浴中提取30 min，然后4 000 r/min離心5 min，過濾得上清液定容至50 mL，按照制備蘆丁標準曲線步驟計算總黃酮含量，選得率制高點為最佳提取料液比。

1.4.5 提取時間

準確稱取樣品粉末0.2 g，按料液比1∶70(g∶mL)加入40%乙醇14 mL，混勻后在超聲波功率為300 W，超聲波頻率為低頻(35 kHz)，60℃水浴中提取，其中救心菜提取時間梯度為30，50，70，90，110，130 min，明月草為110，130，150，170，190 min，銅錢草為30，50，70，90，110，130 min，然后4 000 r/min離心5 min，過濾得上清液定容至50 mL，按照制備蘆丁標準曲線步驟計算總黃酮含量，選取得率最高點為最佳提取時間。

1.5 黃酮得率的計算方法

參照趙娟娟[15]對分心木總黃酮的提取研究方法，計算總黃酮得率(RE)，其公式為

式中，C為提取液中總黃酮濃度(mg/mL)，V為提取液體積(mL)，M為樣品粉末質(zhì)量(g)。

在對上述提取工藝的選擇中，優(yōu)選各個單因素總黃酮得率最高點作為最終總黃酮提取方法，測定3種菜總黃酮含量。

1.6 3種蔬菜粗提液體外抗氧化活性

1.6.1 粗提液對DPPH·的清除作用

3種蔬菜葉片粗提液與DPPH溶液等體積混合，靜置30 min后用無水乙醇作參比，在517 nm 處測定其吸光值A(chǔ)1；測定不同產(chǎn)地的粗提液與無水乙醇等體積混合液的吸光值A(chǔ)2，DPPH溶液與無水乙醇等體積混合液的吸光值A(chǔ)0，取3 次平行試驗結(jié)果根據(jù)下列公式計算試樣對DPPH·的清除率[15]。以VC作對照。

100%。

1.6.2 總還原力的測定

取1.0 mL 粗提液加入1%鐵氰化鉀溶液和0.22 mol/L磷酸鹽緩沖液各2.5 mL，混合均勻后于50℃水浴中反應30 min，迅速冷卻加入10%三氯乙酸2.5 mL，4 000 r/min離心10 min。最后取2.5 mL上清液加入2.5 mL蒸餾水和2.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻后靜置10 min，于700 nm處測定吸光值[15]。以VC作對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取溫度

由圖1可知，3種菜總黃酮得率隨著提取溫度的提高，其變化趨勢并不明顯，基本處于同一水平線。救心菜和銅錢草在70℃得率最高，分別為1.56%和2.57%，而明月草在60℃達到最高點，為0.63%。同一提取溫度下，3種菜的總黃酮得率表現(xiàn)為銅錢草>救心菜>明月草。

2.1.2 乙醇濃度

3種菜總黃酮得率隨著提取溶劑濃度的增大有不同程度的變化(圖2)，其中銅錢草的變化程度最明顯，呈現(xiàn)“凸”字形，以60%乙醇提取時總黃酮得率最高，為2.56%，而救心菜和明月草以80%乙醇提取時總黃酮得率最高，在乙醇濃度60%以下，3種菜總黃酮含量表現(xiàn)為銅錢草>救心菜>明月草，而超過80%之后，銅錢草總黃酮得率明顯下降，開始低于救心菜。

圖1 提取溫度對3種菜總黃酮得率的影響

圖2 乙醇濃度對3種菜總黃酮得率的影響

2.1.3 料液比

由圖3可知，3種菜總黃酮得率隨著提取溶劑的增多，其得率也呈現(xiàn)不同變化。其中銅錢草和明月草受提取液體積的影響比較大，但都在1∶70時得率最高，分別為2.41%和0.85%。而救心菜的總黃酮得率基本不受提取液的影響。

圖3 料液比對3種菜總黃酮得率的影響

2.1.4 超聲功率

3種菜總黃酮的提取受到超聲功率的影響不大(圖4)，隨著超聲功率的增大，其黃酮得率變化都不大，整體表現(xiàn)為銅錢草>救心菜>明月草。

圖4 超聲功率對3種菜總黃酮得率的影響

2.1.5 提取時間

由圖5可知，提取時間對3種菜總黃酮得率影響很大，銅錢草和救心菜在較短時間內(nèi)便有黃酮析出，而明月草所需時間較長，約需120 min以上，而銅錢草總黃酮得率隨時間的延長在30—50 min內(nèi)有個明顯增幅，于60 min趨向穩(wěn)定。

圖5 提取時間對3種菜總黃酮得率的影響

2.2 3種菜總黃酮含量比較

在70℃、超聲功率180 W、乙醇濃80%和料液比1∶80 g/mL條件下提取110 min，救心菜總黃酮含量為2.14%；在60℃、超聲功率180 W、乙醇濃80%和料液比1∶80 g/mL條件下提取170 min，明月草總黃酮含量為1.27%；在70℃、超聲功率300 W、乙醇濃度60%和料液比1∶70 g/mL下，銅錢草總黃酮含量為5.37%，銅錢草總黃酮含量最高(圖6)。

圖6 3種菜總黃酮含量對比

2.3 3種菜的抗氧化活性比較

由圖7a可知，救心菜、明月草、銅錢草粗提液對DPPH·的清除能力以救心菜最高，約為93.46%，而明月草和銅錢草對DPPH·的清除能力最高約為87.03%和87.20%，比VC (95.94%)低。隨著加樣體積的增加，明月草對DPPH·的清除能力顯著提升，而救心菜和銅錢草無顯著變化?？傔€原力比較結(jié)果為VC>救心菜>銅錢草>明月草，VC隨著加樣體積的增加其吸光值有明顯增幅，而3種菜無明顯變化。

圖7 3種菜抗氧化活性對比

3 討論

本研究通過超聲波輔助醇溶液提取救心菜、明月草和銅錢草的總黃酮，發(fā)現(xiàn)3種蔬菜的提取條件各有不同。其中隨著提取溶劑乙醇濃度的增加，其總黃酮得率變化也很顯著，過高濃度乙醇或可將其他醇溶性物質(zhì)析出，影響總黃酮提??；隨著提取溶劑的增多，總黃酮得率并沒有相應增加，所以在提取工藝中要注意合理利用溶劑，避免浪費。此外3種蔬菜對于總黃酮的最優(yōu)提取時間也不盡相同，可能是因為各試材本質(zhì)的差異，對于物質(zhì)的析出所需條件不同。

試驗結(jié)果表明救心菜、明月草和銅錢草總黃酮類物質(zhì)含量分別為2.14%、1.27%和5.37%，以銅錢草總黃酮含量最高，但是抗氧化活性研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其總還原力表現(xiàn)為VC>救心菜>銅錢草>明月草，這可能是由于其他活性物質(zhì)如多酚、多糖、皂苷等也參與了DPPH·自由基和Fe3+的還原，有待于對其主要活性物質(zhì)進行更廣泛和深入的對比分析。

臨床試驗表明，食用救心菜數(shù)月可抑制和改善高血壓和心臟病等心腦血管疾病，有寧心平肝、安神補血、清熱解毒等功效，在推廣種植方面的優(yōu)勢更好，其對種植土壤條件要求不高，具有耐旱、耐寒、耐陰、耐濕和耐瘠薄等特性，適應性強，且能夠進行分株和扦插繁殖，存活率高，定植一次就能夠連續(xù)多年收獲新鮮莖葉，具有極大的市場價值[16-17]。明月草可治療急性結(jié)膜炎、小兒高熱、心肺積熱等，也有清熱解毒、涼血止血等功效，對于種植土壤條件要求不嚴，但是氣候環(huán)境對于其扦插的成活率影響較大，一般選擇在春季進行扦插繁殖[18-19]。銅錢草可清熱、鎮(zhèn)痛、利濕、治腹痛、小便不利等，一般生長在濕潤的路旁、草地、河溝邊、湖灘、溪谷及山地等潮濕的環(huán)境，人工繁殖和野生繁殖[20]。

總的來說，救心菜在推廣種植、市場開發(fā)方面的優(yōu)勢更好，總黃酮含量也相對較高，是藥食兼用的理想保健品。而明月草和銅錢草總黃酮含量雖高，但是其抗氧化活性并不好，在推廣和栽培方面也相對較差，因此開發(fā)成為藥食兼用的理想保健品的價值相對較低。