亮菌多糖的理化性質(zhì)及生物活性研究①

蔡晶晶，宋小平，王雅潔，王 薔

(安徽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校藥學(xué)系，安徽 合肥 230601)

0 引 言

亮菌(Armillariellatabescens)也叫青杠菌、假蜜環(huán)菌，屬于口蘑科，假蜜環(huán)菌屬，營養(yǎng)豐富，是一種稀有、昂貴的野生食用真菌，在國內(nèi)廣泛分布。同時(shí)亮菌具有一定的藥用價(jià)值，主要用于胃炎、膽管炎、膽囊炎等的治療[1]。亮菌中大分子物質(zhì)有良好的生物活性，其中亮菌多糖被認(rèn)為具有提高免疫、抗氧化、抗衰老、預(yù)防心腦血管疾病等功效[1]。亮菌糖肽提取物制劑能夠有效抑制慢性萎縮性胃炎黏膜腺體的萎縮[2]，逆轉(zhuǎn)胃癌前病變[3]、調(diào)節(jié)腸道免疫應(yīng)答、促進(jìn)動(dòng)物幼崽正常腸道菌群的建立[4]，逆轉(zhuǎn)酒精導(dǎo)致的肝損傷，促進(jìn)核酸、蛋白質(zhì)的生物合成和組織損傷修復(fù)等功效[5]。但亮菌多糖為極性大分子復(fù)合物，結(jié)構(gòu)不均一，國內(nèi)外對其構(gòu)效關(guān)系等機(jī)制研究也十分有限[6-7]。

1 儀器與試劑

1)儀器：凝膠色譜儀(ELEOS System，Wyatt)；液相色譜儀(Agilent 1200)；紫外可見分光光度計(jì)(UV-1100，上海美譜達(dá)儀器有限公司)；酶標(biāo)分析儀(DNM-9602，北京普朗新技術(shù)有限公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Forma 3111)。

2)試劑：亮菌固體發(fā)酵物由合肥誠志生物制藥有限公司提供。RPMI-1640(Hyclone公司)、青鏈霉素混合液(100 X)(Solarbio公司)、0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化液(Solarbio公司)、DMSO(Amresco公司)、胎牛血清(GIBCO公司)；MTT、單糖標(biāo)準(zhǔn)品等均為sigma公司產(chǎn)品；乙腈為色譜純；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 亮菌多糖提取及分級(jí)沉淀方法

依據(jù)文獻(xiàn)[8]方法提取亮菌粗多糖(ATP-ALL)。然后加入無水乙醇至粗多糖溶液體積的20%，邊加邊攪拌均勻，4 ℃靜置沉淀4 h后，5000 g離心5 min，取沉淀，冷凍干燥后記為ATP-20組分；上清中加無水乙醇至糖溶液體積的40%，靜置沉淀約12 h后，5000 g離心5 min，取沉淀，冷凍干燥后記為ATP-40組分；上清中加無水乙醇至糖溶液體積的60%，其余操作同ATP-40組分，得ATP-60組分；上清中加無水乙醇至多糖溶液體積的80%，其余操作同ATP-40組分，得ATP-80組分。稱重并計(jì)算得率。

2.2 單糖組成分析

采用1-苯基-3-甲基-吡唑啉酮柱前衍生高效液相色譜法(PMP-HPLC)法測定ATP-20、ATP-40、ATP-60、ATP-80的單糖組成[8]，方法如下：

以葡萄糖等十種單糖的混合對照品溶液同法處理做對照。精密稱定適量亮菌多糖凍干粉置100 mL錐形瓶中，加入1.0 mL的4 mol/L的三氟乙酸溶液，120 ℃水解2 h。70 ℃水浴，氮?dú)獯蹈?。再加?.5 mol/L的PMP甲醇溶液和0.3 mol/L的NaOH溶液各0.5 mL，充分混勻后，于水浴70 ℃中反應(yīng)30 min。冷卻至室溫后，加入0.3 mol/L HCl 0.5 mL中和。再加入1 mL氯仿充分振蕩萃取，去除氯仿層，共萃取三次。水層用0.22μm濾膜過濾，待測。

色譜分析條件：Agilent 1200液相色譜儀，Thermo C18色譜柱；流動(dòng)相為0.1 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液：乙腈=82:18(v/v)；流速為1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長為245 nm。

2.3 純度及分子量測定

采用高效排阻色譜與多角度激光散射儀及示差檢測串聯(lián)(HPSEC-MALLS-RID)法測定各組分的分子量[9]。該法測定多糖分子量，因MALLS為分子量響應(yīng)型檢測器，無需標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線可直接獲得多糖的絕對分子量。

稱取5 mg樣品溶解在水中制成2 mg/mL溶液，4000 g離心5 min取上清，經(jīng)過0.22 μm水相濾膜過濾后進(jìn)行分析。

色譜分析條件：Waters515泵；色譜柱OHpak SB-806HQ，流動(dòng)相為含0.02%疊氮化鈉的超純水，流速1mL/min，柱溫40 ℃，運(yùn)行Astra 5.3.4分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。

2.4 抗氧化實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[10]方法測定亮菌多糖羥基自由基清除作用。配制不同濃度的多糖樣品，各濃度均做3支平行樣品管。依次加入9 mmol/L FeSO4溶液0.5 mL，9 mmol/L乙醇-水楊酸溶液0.5 mL，上述多糖溶液0.5 mL，去離子水3.5 mL，10mmol/L雙氧水1 mL。以等體積水代替多糖樣品做空白管，以等體積水代替乙醇-水楊酸溶液做對照管。各管搖勻，37 ℃水浴加熱15 min后取出，測510 nm處的吸光值，以蒸餾水管調(diào)零。

·OH自由基清除率=1-[(A樣品-A對照)/A空白]

2.5 體外對脾淋巴細(xì)胞增殖作用實(shí)驗(yàn)

分別稱取各個(gè)樣品5 mg，溶解于適量的培養(yǎng)液中，經(jīng)0.22 μm的水相微孔濾膜過濾除菌。使用前分別取適量的樣品溶液用培養(yǎng)液稀釋成高、中、低濃度的工作液，分別為2.5、0.5、0.1 mg/mL。

依據(jù)文獻(xiàn)方法[11]制備小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化，鏡檢計(jì)數(shù)后制成5×106個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液。設(shè)置組別如下：空白組只加培養(yǎng)液200 μL/孔；陰性對照組加細(xì)胞液100 μL與培養(yǎng)液100 μL；樣品組中每個(gè)樣品高、中、低濃度分別單獨(dú)加樣20 μL(細(xì)胞液100 μL+樣品20 μL，培養(yǎng)基補(bǔ)充至200 μL)。各組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔?；靹蚝蠓湃肱囵B(yǎng)箱5% CO237 ℃孵育48 h。每孔加入20 μL的MTT染色液(5 mg/mL)，5% CO2，37 ℃反應(yīng)4 h后，除上清液，加入100 μL的DMSO充分振蕩，避光放置10-15 min直至藍(lán)色顆粒充分溶解，酶標(biāo)儀570 nm處檢測。刺激指數(shù)為實(shí)驗(yàn)組OD值與陰性對照組OD值的比值。

3 結(jié)果與分析

3.1 亮菌多糖各醇沉組分的得率

根據(jù)冷凍干燥后的重量計(jì)算，ATP-20、ATP-40、ATP-60、ATP-80的得率分別為16.98%、13.10%、10.29%、41.20%，以甘露糖為標(biāo)準(zhǔn)單糖，硫酸苯酚法[8]測定ATP-ALL，ATP-20、ATP-40、ATP-60、ATP-80組分的多糖純度，結(jié)果分別為56.26%、63.90%、70.41%、66.47%、84.82%。數(shù)據(jù)表明，醇濃度為80%時(shí)沉淀下來的多糖所占比例最大，得率最高，多糖純度最高。

3.2 分級(jí)沉淀各組分單糖組成分析

表1 亮菌多糖各醇沉組分的單糖組成

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示亮菌多糖單糖組成超過1%的有葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)、巖藻糖(Fuc)、葡萄糖醛酸(GlcUA)，此外還含有極少量的核糖(Rib)、鼠李糖(Rha)、半乳糖醛酸(GalUA)。ATP-20、ATP-40中葡萄糖的含量高，分別為74.07%、63.61%；ATP-60中葡萄糖含量(44.73%)降低，甘露糖、巖藻糖含量升高；而ATP-80組分中，木糖、阿拉伯糖含量顯著增加，甘露糖、鼠李糖葡萄糖醛酸含量也較高。

3.3 各組分分子量及分子量分布測定結(jié)果

如圖1所示，多角度激光散射儀(MALLS)與示差檢測儀(RI)色譜峰的出峰時(shí)間與峰形均有一定的差異，這主要是因?yàn)镸ALLS為分子響應(yīng)型檢測器，而RI為濃度相應(yīng)型檢測器[13]，在凝膠色譜中，大分子物質(zhì)被優(yōu)先洗脫出來，此時(shí)因?yàn)闈舛容^低，RI無響應(yīng)，而MALLS對大分子靈敏，響應(yīng)值高。

圖1 多糖ATP-20(A)、ATP-40(B)、ATP-60(C)、ATP-80(D)的HPSEC-MALLS-RID色譜圖

各個(gè)組分的重均分子量、數(shù)均分子量等數(shù)值見表2所示。

表2 ATP-20、ATP-40、ATP-60、ATP-80的分子量

如表2所示，除ATP-20外，其余幾個(gè)組分隨著沉淀時(shí)乙醇濃度的升高，所得多糖的重均分子量、數(shù)均分子量逐步降低，而分子量的分散指數(shù)Mw/Mn也逐步降低。但是ATP-20的重均分子量低于ATP-40，分析原因主要是因?yàn)锳TP-20在熱水中溶解度較其他組分低，經(jīng)過微孔濾膜過濾處理后，有少部分大分子多糖損失。ATP-20、ATP-40兩個(gè)組分的Mw/Mn都大于2，分子量分布比較寬，而ATP-60、ATP-80的Mw/Mn值分別為1.358、1.217，表明其分子量分布相對較窄，均一性良好。

3.4 羥基自由基清除率測定結(jié)果

羥基自由基(·OH)會(huì)破壞細(xì)胞膜，使蛋白變性，損傷基因的分子結(jié)構(gòu)，對機(jī)體的危害很大。如圖2所示，亮菌多糖分級(jí)沉淀各組分都對·OH自由基有清除作用，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系。不同多糖組分對·OH自由基抑制率的大小依次為：ATP-ALL>ATP-80>ATP-20>ATP-40>ATP-60，其中ATP-80在5 mg/mL時(shí)，·OH自由基清除率為76.08%。

圖2 羥基自由基清除率檢測ATP-20、ATP-40、ATP-60、ATP-80的抗氧化活性

3.5 體外脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如表3所示，亮菌多糖ATP-20、ATP-40、ATP-60、ATP-80對體外淋巴細(xì)胞的增殖均有一定的刺激作用，其中ATP-80在10 μg/mL～250 μg/mL范圍內(nèi)的促淋巴細(xì)胞增殖作用高于其他組分，在低濃度下仍然具有顯著的促增殖活性(*p<0.05)。ATP-ALL活性最高，但在同等質(zhì)量下，ATP-80組與ATP-ALL結(jié)果差異不顯著，而其他幾組較ATP-ALL均差異顯著，提示活性的主要成分在ATP-80組分。

表3 ATP-20、ATP-40、ATP-60、ATP-80對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

4 結(jié) 語

(1)分級(jí)沉淀后的四個(gè)組分的相對分子質(zhì)量是依次降低的，其中ATP-20、ATP-40分子量分布范圍廣，組成更復(fù)雜，而ATP-60、ATP-80相對較均一，且ATP-80的收率、純度顯著高于其他組分。不同組分之間單糖組成相似，均主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖、葡萄糖醛酸七種單糖構(gòu)成，但組成比例有差異。單糖組成類別比已有資料[6-7]報(bào)道的更豐富，可能是檢測技術(shù)的進(jìn)步，及長時(shí)間固體發(fā)酵，有更豐富的代謝產(chǎn)物。大分子量多糖中主要成分是葡聚糖，而小分子量越小雜糖含量越高，尤其是木糖、阿拉伯糖等含量升高顯著。推測這是小分子量多糖如ATP-80生物活性較高的原因之一。

(2)對于亮菌多糖抗氧化活性與免疫活性的研究，四種組分都具備·OH自由基清除活性，并呈明顯的劑量依賴關(guān)系。分子量最小的ATP-80活性最高，在5 mg/mL時(shí)，·OH自由基清除率達(dá)76.08%。在體外免疫細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，除ATP-60 的低劑量組外，其余樣品都顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，尤其以ATP-80活性高，與粗多糖ATP-ALL的活性無明顯差異。因此認(rèn)為ATP-80為亮菌多糖的活性主要組分。有報(bào)道稱1～3萬的枸杞多糖抗氧化活性最強(qiáng)[12]，另外有研究表明分子量在1.5×104～4.4×104之間的小分子多糖生物活性最高[13]，這與ATP-80的分子量范圍吻合。在生物體內(nèi)，分子量太大的不易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其活性功能，分子量過低的無法產(chǎn)生活性的聚合結(jié)構(gòu)，適當(dāng)分子量的多糖是維持其活性的基礎(chǔ)。

綜上所述，亮菌混合粗多糖的抗氧化與免疫活性均為最佳，優(yōu)于各分級(jí)沉淀組分，體現(xiàn)出不同組分在抗氧化及免疫方面的協(xié)同活性大于單一組分。而ATP-80組分得率高，溶解度好，活性略低于粗多糖。由于其分子量相對均一，在樣本制備、質(zhì)量控制上有很大優(yōu)勢，結(jié)構(gòu)也容易解析，適用于深入的亮菌糖生物學(xué)研究。