樺褐孔菌多糖對高脂飲食誘導的高脂血癥大鼠血脂和肝臟的保護作用及機制

崔敬愛，王思霽，劉 暢，于 婷，陳曉平

（吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118）

近年來，隨著人們生活水平不斷提高，高脂肪和高蛋白攝入量的增加以及運動量的減少，導致血液中大量脂肪聚積，高脂血癥的發(fā)病率急劇增長[1]。據(jù)統(tǒng)計，由高脂血癥而引起的如冠心病、動脈粥樣硬化等并發(fā)癥的人群同時在逐年遞增，并呈現(xiàn)低齡化趨勢[2-3]。臨床使用較多的控制血脂水平的藥物為他汀類和貝特類，其優(yōu)點為使用初期療效顯著，但長期服用會產(chǎn)生副作用，嚴重危害患者健康[4]。因此，飲食干預的方法引起了我國居民的注意，健康、安全、可用于降低血脂水平的天然產(chǎn)物受到了廣泛的關(guān)注[5-6]。

樺褐孔菌（Inonotus obliquus (Fr.) Pilat），又稱白樺茸、西伯利亞靈芝等[7]。樺褐孔菌主要生長在俄羅斯、日本、黑龍江、吉林長白山等寒冷地區(qū)，因此樺褐孔菌能夠耐受零下40～50 ℃的低溫[8]。樺褐孔菌具有降糖降脂、抗癌、抗氧化、提高免疫力等作用，能有效預防和治療腫瘤、肝臟疾病、胃腸道及食道疾病等[9-10]。眾多研究發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌藥用主要活性成分是多糖，它可以有效消除活性氧自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基等[11]。樺褐孔菌多糖的降血脂作用報道較少，其研究的作用效果僅限于對血清總膽固醇的影響。本實驗旨在通過高脂飲食誘導雄性SD大鼠引發(fā)高脂血癥，探討樺褐孔菌多糖對高脂血癥大鼠血脂水平和肝損傷機制的影響。本研究對于樺褐孔菌及樺褐孔菌多糖類保健食品的開發(fā)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

40 只體質(zhì)量180～220 g的SPF級雄性SD大鼠，由吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學學院實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（吉）2018-0007。

高脂飼料配方：普通飼料73.8%（質(zhì)量分數(shù)，下同）、膽固醇10%、豬油10%、膽酸鹽0.2%、蛋黃粉1%、蔗糖5%[12]。

飼養(yǎng)條件：室溫20～25 ℃、相對濕度40%～60%的清潔級動物飼養(yǎng)室，籠具及墊料定期清洗更換。

樺褐孔菌為市售；無水乙醇、氯仿、正丁醇河南西伯化工產(chǎn)品有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）試劑盒、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（asparate aminotransferase，AST）試劑盒、脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，F(xiàn)AS）試劑盒、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶（human hydroxymethylglutaryl CoA reductase，HMGCR）試劑盒 上海穎心實驗室設(shè)備有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

H01-B電子天平 北京和田興業(yè)儀器有限公司；HB-6磁力攪拌恒溫水浴鍋 金壇市良友儀器設(shè)備有限公司；RE-52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 鞏義市予泰儀器設(shè)備有限公司；FD-2A-30真空冷凍干燥機 江蘇天翔儀器有限公司；LG16高速離心機 北京雷勃爾設(shè)備有限公司；UV762型紫外-可見分光光度計 上海精科儀器廠；SPX-600立式壓力蒸汽滅菌器 濟南捷島分析儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樺褐孔菌多糖的提取

樺褐孔菌在進行粉碎、除雜、干燥后，過40 目篩。

量取1 kg樺褐孔菌菌粉，加4 倍蒸餾水，100 ℃水浴30 min，過濾，濾渣按料液比1∶2加蒸餾水，100 ℃水浴30 min，過濾，混合2 次濾液，70～80 ℃濃縮至800 mL，10 000 r/min、25 ℃離心15 min，收集上清液，70～80 ℃濃縮至200 mL，加無水乙醇，讓乙醇在體系中的體積分數(shù)達到80%，靜置24 h，離心取沉淀。按氯仿：正丁醇體積比5∶1配制Sevag試劑，數(shù)次對沉淀脫蛋白，12 h流水透析，12 h蒸餾水靜置，濃縮，冷凍干燥即得樺褐孔菌多糖[13]。經(jīng)多次實驗，得出樺褐孔菌多糖的平均提取率為5.89%，多糖的質(zhì)量分數(shù)為83%。

1.3.2 實驗動物分組設(shè)計

40 只雄性SD大鼠普通飼料適應(yīng)喂養(yǎng)1 周，將其隨機分為5 組，即正常對照組（Control）、高脂模型組（Model）以及樺褐孔菌多糖低劑量組（IOP-L）、中劑量組（IOP-M）、高劑量組（IOP-H），每組8 只[14]。正常對照組飼喂普通飼料，其余各組大鼠進行高脂飲食，實驗期間自由采食、采水。

8 周后，禁食不禁水12 h，除正常對照組外，各組隨機抽取2 只大鼠，測定血清TC、TG水平，判定高脂血癥大鼠模型是否構(gòu)造成功。確定造模成功后，上午灌胃1 次/d，連續(xù)干預5 周。分組灌胃劑量見表1。

表1 實驗動物分組設(shè)計Table 1 Experimental design and animal grouping

1.3.3 檢測指標

灌胃5 周后稱量各組大鼠的體質(zhì)量，禁食不禁水12 h，腹主動脈取血，頸椎脫臼致死，解剖，分離心、肝、脾、腎等臟器，用生理鹽水沖洗干凈，吸干多余水分。肝臟放入冷凍管中，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.1 SD大鼠體質(zhì)量的測定

實驗期間每天觀察大鼠的進食、排泄狀況，每周稱量一次體質(zhì)量并記錄。

1.3.3.2 SD大鼠血清指標的測定

將采集的血液樣本常溫放置2 h，3 000 r/min、4 ℃離心10 min，分離血清，根據(jù)試劑盒說明書逐一測定TC、TG、HDL、LDL的濃度并記錄。

1.3.3.3 SD大鼠肝組織勻漿及肝臟指標的測定

量取肝臟0.1 g，加入0.9 mL冰冷的生理鹽水，于冰水浴中充分研磨，制成1 g/10 mL的勻漿，3 000 r/min、4 ℃離心15 min取上清液。按照試劑盒說明書測定SOD、MDA、GSH-Px、AST、ALT、FAS、HMGCR的活力并記錄。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2019軟件對數(shù)據(jù)進行處理，SPSS 20軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示，組間t檢驗分析差異顯著性，P＜0.05表示組間差異顯著，P＜0.01表示組間差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 樺褐孔菌多糖對大鼠體質(zhì)量的影響

圖1 樺褐孔菌多糖對大鼠體質(zhì)量的影響Fig. 1 Effect of polysaccharide from Inonotus obliquus on body mass of rats

如圖1所示，建模期間，樺褐孔菌多糖各劑量組較對照組大鼠體質(zhì)量增長速率較快，說明食用高脂飼料能顯著增加體質(zhì)量。灌胃兩周后，IOP-H組開始與模型組呈顯著性差異（P＜0.05）；5 周后，各劑量組與模型組呈極顯著差異（P＜0.01）?？梢钥闯觯瑯搴挚拙嗵悄苡行p輕高脂飲食誘導的大鼠體質(zhì)量的快速增長。

2.2 樺褐孔菌多糖對大鼠血清脂質(zhì)水平的影響

2.2.1 樺褐孔菌多糖對大鼠血清中TC濃度的影響

圖2 樺褐孔菌多糖對大鼠血清中TC濃度的影響Fig. 2 Effect of polysaccharide from Inonotus obliquus on serum TC content in rats

如圖2所示，模型組大鼠血清TC濃度極顯著高于對照組（P＜0.01），表明高脂飲食顯著提高大鼠血清TC的水平。與模型組相比，IOP-L、IOP-M和IOP-H組大鼠血清TC濃度分別顯著下降4.9%、5.8%、31%，說明樺褐孔菌多糖能夠抑制大鼠血清中TC濃度的上升，并且高劑量效果尤為顯著。

2.2.2 樺褐孔菌多糖對大鼠血清中TG濃度的影響

圖3 樺褐孔菌多糖對大鼠血清中TG濃度的影響Fig. 3 Effect of polysaccharide from Inonotus obliquus on serum TG content in rats

如圖3所示，模型組大鼠血清TG濃度極顯著高于對照組（P＜0.01）。與模型組相比，IOP-L、IOP-M和IOP-H組大鼠血清中TG濃度分別極顯著下降30%、42%、41.5%（P＜0.01）。說明一定劑量的樺褐孔菌多糖能夠較好地調(diào)節(jié)血清TG水平。

2.2.3 樺褐孔菌多糖對大鼠血清中HDL濃度的影響

如圖4所示，模型組大鼠血清HDL濃度極顯著低于對照組（P＜0.01）。與模型組相比，IOP-L、IOP-M和IOP-H組大鼠血清中HDL濃度分別極顯著上升16.9%、17.8%、13.2%（P＜0.01）。說明樺褐孔菌多糖可以顯著提高血清HDL水平，且不受劑量影響。

圖4 樺褐孔菌多糖對大鼠血清中HDL濃度的影響Fig. 4 Effect of polysaccharide from Inonotus obliquus on serum HDL content in rats

2.2.4 樺褐孔菌多糖對大鼠血清中LDL濃度的影響

圖5 樺褐孔菌多糖對大鼠血清中LDL濃度的影響Fig. 5 Effect of polysaccharide from Inonotus obliquus on serum LDL content in rats

如圖5所示，模型組大鼠血清LDL濃度極顯著高于對照組（P＜0.01）。與模型組相比，IOP-L、IOP-M和IOP-H組大鼠血清中LDL分別顯著降低4.2%、9.6%、33%。說明樺褐孔菌多糖能夠有效降低血清中LDL的水平，高劑量作用效果更加顯著。

2.3 樺褐孔菌多糖對大鼠抗氧化指標的影響

2.3.1 樺褐孔菌多糖對大鼠肝臟中SOD和GSH-Px活力的影響

圖6 樺褐孔菌多糖對大鼠肝臟中SOD和GSH-Px活力的影響Fig. 6 Effect of polysaccharide from Inonotus obliquus on the activity of SOD and GSH-Px in rat liver

SOD是體內(nèi)清除自由基的重要活性物質(zhì)，GSH-Px也具有清除自由基和衍生物的作用，而且可以間接反映出肝組織的還原能力[15]。圖6顯示了灌胃5 周后各組大鼠肝臟組織中SOD和GSH-Px的變化。模型組大鼠肝臟中SOD和GSH-Px的活力較對照組極顯著下降（P＜0.01），這說明高脂飲食引起機體清除自由基的能力被有效削弱。IOP-H組SOD和GSH-Px活力較模型組分別極顯著提升了14.7%和38.1%（P＜0.01），表明一定劑量的樺褐孔菌多糖能夠提高機體SOD和GSH-Px的活力，使大鼠肝組織消除氧自由基和抗氧化能力增強。

2.3.2 樺褐孔菌多糖對大鼠肝臟中MDA含量的影響

圖7 樺褐孔菌多糖對大鼠肝臟中MDA含量的影響Fig. 7 Effect of polysaccharide from Inonotus obliquus on MDA content in rat liver

生物體發(fā)生脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物有很多，其中水平最高的為MDA，它會加劇生物膜的損傷[16]。圖7顯示了灌胃5 周后各組大鼠肝組織中MDA含量的變化。模型組大鼠肝臟中MDA含量較對照組上升了58.6%（P＜0.01），說明高脂飲食削弱生物體抗氧化能力。與模型組相比IOP-L、IOP-M和IOP-H組大鼠MDA含量分別極顯著下降8.4%、11.5%、21.7%（P＜0.01）。表明樺褐孔菌多糖能有效抑制機體的過氧化作用、抑制MDA的產(chǎn)生從而減少脂質(zhì)過氧化損傷。

2.4 樺褐孔菌多糖對大鼠肝損傷指標的影響

圖8 樺褐孔菌多糖對大鼠肝臟中ALT和AST活力的影響Fig. 8 Effect of polysaccharide from Inonotus obliquus on ALT and AST levels in rat liver

由圖8可知，模型組大鼠肝臟中ALT和AST的活力明顯高于對照組（P＜0.01），說明長期食用高脂飼料會損害大鼠肝臟細胞。樺褐孔菌多糖各劑量組大鼠的ALT和AST活力均低于模型組（P＜0.01），說明樺褐孔菌多糖可以降低由高脂飲食造成的肝細胞損傷。

2.5 樺褐孔菌多糖對高脂血癥大鼠代謝指標的影響

2.5.1 樺褐孔菌多糖對大鼠FAS活力的影響

圖9 樺褐孔菌多糖對大鼠肝臟FAS活力的影響Fig. 9 Effect of polysaccharide from Inonotus obliquus on the activity of FAS in rat liver

如圖9所示，模型組大鼠的FAS活力較對照組升高了24.5%（P＜0.01）。與模型組相比，IOP-H和IOP-M組FAS活力分別下降21%和19.4%，說明樺褐孔菌多糖在一定劑量下能夠抑制脂肪酸合成酶的活性。

2.5.2 樺褐孔菌多糖對大鼠HMGCR活力的影響

圖10 樺褐孔菌多糖對大鼠肝臟HMGCR活力的影響Fig. 10 Effect of polysaccharide from Inonotus obliquus on HMGCR activity in rat liver

HMGCR是體內(nèi)催化膽固醇合成的關(guān)鍵酶[17]。如圖10所示，模型組大鼠的HMGCR 活力較對照組升高了12.5%（P＜0.01），說明高脂飲食會促進大鼠體內(nèi)HMGCR活力升高，膽固醇合成速率加快。與模型組相比，IOP-L、IOP-M和IOP-H組HMGCR活力分別降低9%、18.6%、23%。結(jié)果表明樺褐孔菌多糖通過抑制HMGCR的活性來減緩膽固醇合成的速率，進一步起到降低血脂的作用。

3 討 論

高脂血癥是一種由脂質(zhì)代謝紊亂引起的常見疾病，它是冠心病、心肌梗塞、動脈粥樣硬化等疾病的導火索，將會對人體造成系統(tǒng)性、嚴重時不可逆轉(zhuǎn)的傷害[18]。據(jù)調(diào)查，世界上每年由于心腦血管疾病而死亡的人數(shù)高達1 200萬[19-20]。生物體都是通過血液將脂類物質(zhì)運轉(zhuǎn)于各個器官和組織之間，血液中脂類物質(zhì)的濃度可以直接并充分地反映機體的脂肪代謝情況[21]。高脂血癥患者的能量攝入比普通人高，血液黏稠，主要臨床表現(xiàn)為血液中TC、TG、LDL水平異常升高和HDL異常降低[22]。實驗結(jié)果說明，樺褐孔菌多糖能有效控制高脂飲食引起的高脂血癥大鼠的體質(zhì)量，并能降低大鼠血清中TC、TG和LDL的濃度，增加HDL的濃度，具有調(diào)節(jié)血脂水平的作用，對于高脂血癥的預防和治療具有重要意義。

大量臨床數(shù)據(jù)顯示，高血脂的發(fā)生與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)，氧自由基的增多和過氧化損傷會加劇高血脂的發(fā)生。當機體血脂水平升高時會繼續(xù)引發(fā)血管內(nèi)皮細胞釋放自由基，動脈壁的抗氧化機能被二次損傷，生物體內(nèi)自由基的濃度不斷增加，生物膜的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)發(fā)生，如此往復，生物細胞的結(jié)構(gòu)和功能遭到嚴重破壞。植物多糖的抗氧化作用已被大量研究證實，因此，可以初步判斷樺褐孔菌多糖的降血脂作用與抗氧化損傷有關(guān)。作為清除氧自由基的重要物質(zhì)，SOD可以幫助機體建立抗氧化系統(tǒng)，在生物體的新陳代謝過程修復細胞膜的損傷[23]。GSH-Px可以催化還原反應(yīng)，反向抑制生物體內(nèi)過氧化物的產(chǎn)生速率，增強生物膜的功能特性[24]。MDA是過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，它具有劇毒，會改變血液中脂類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與特性[25]。通常以這3 個指標反映機體脂質(zhì)過氧化損傷的程度。本實驗給予高脂血癥模型大鼠樺褐孔菌多糖5 周后，肝臟中SOD、GSH-Px的活性顯著提高，MDA含量降低。結(jié)果證實，樺褐孔菌多糖可以通過提高抗氧化物酶的活性、降低脂質(zhì)過氧化物的濃度，增加機體清除氧自由基的能力起到抗氧化應(yīng)激、防止氧化損傷的效果，最終達到降血脂作用。

當機體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)持續(xù)一段時間后，會對肝細胞線粒體造成一定程度上的損害，導致大量肝細胞損害甚至死亡，對機體產(chǎn)生不可逆的傷害[26]。ALT和AST是存在于肝臟細胞中主要的轉(zhuǎn)氨酶，可以作為肝細胞損傷的主要敏感性指標，以ALT和AST的水平反映肝臟的健康狀況[27-28]。結(jié)果表明，在樺褐孔菌多糖的調(diào)節(jié)作用下，大鼠肝臟中ALT和AST的活性明顯下降，說明樺褐孔菌多糖可以極大程度減輕肝細胞受損的程度。

多糖類化合物調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的機理主要有減少生物體脂質(zhì)的吸收、降低脂肪的攝入量、抑制脂肪酸合成代謝的關(guān)鍵酶的活性等幾個方面。FAS是合成脂肪酸的重要控制酶，主要存在于肝細胞線粒體當中，HMGCR是催化膽固醇合成的重要酶，它的活性可以反映機體合成膽固醇和脂肪酸的能力[29]。實驗結(jié)果證實，樺褐孔菌多糖能夠較明顯地抑制模型大鼠肝臟中FAS和HMGCR的活力，從而降低脂肪酸的合成與代謝，抑制膽固醇的合成，在機體代謝調(diào)節(jié)方面降低血脂水平。

藥用真菌多糖是調(diào)節(jié)血脂的主要功能因子之一，大量動物實驗表明，多糖及富含多糖類化合物的物質(zhì)具有顯著的降血脂效果。其作用機制包括促進膽固醇酯化進入肝臟，從而加速清除血液中的膽固醇，進一步降低血脂[30]。多糖類物質(zhì)是樺褐孔菌中的發(fā)揮主要作用的功能成分，它與加強機體抗氧化活性、降低脂質(zhì)過氧化損傷有密切相關(guān)。本研究表明了樺褐孔菌多糖與脂血癥患者的血脂水平之間有一定的量效關(guān)系，樺褐孔菌多糖降血脂作用可能與抑制機體過氧化損傷、降低膽固醇的合成有關(guān)，但是具體作用機理還需進一步的研究。