夏枯草蜂蜜提取物對硫酸葡聚糖誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

萬正瑞，李強(qiáng)強(qiáng)，王 凱，吳黎明

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093）

蜂蜜是一種重要的蜂產(chǎn)品，不僅可作為傳統(tǒng)滋補(bǔ)食品和天然甜味劑[1]，也有促進(jìn)傷口愈合、組織再生以及緩解胃腸道疾病、牙齦炎和其他疾病的作用[2]。不同品種蜂蜜的成分、口感、顏色等取決于其蜜源的類型、地理位置、氣候以及采集蜂蜜的蜂種，同時(shí)也受加工工藝和貯藏條件的影響[3]。我國蜜粉源植物種類十分豐富，是世界上最大的蜂蜜生產(chǎn)國，特色蜂產(chǎn)品種類豐富。近年來，開展特色蜂蜜化學(xué)成分與營養(yǎng)功能評價(jià)研究已經(jīng)成為國外蜂產(chǎn)品開發(fā)利用的新方向，但針對藥用植物蜂蜜的研究還十分有限[1]。

夏枯草（Prunella vulgaris）為唇形科植物，是我國中部地區(qū)廣泛種植的一種中藥材[4-5]，具有清火明目的功效，其含有多種活性成分，如三萜類、甾體類、黃酮類、香豆素類等[6]。已有研究表明夏枯草具有廣泛的藥理作用，如抗病毒[7]、免疫抑制活性[8]、抗氧化和清除自由基[9]、抗腫瘤[10]等，臨床應(yīng)用已有很長的歷史。夏枯草蜂蜜是蜜蜂采集夏枯草植物的花蜜并與自身分泌物混合后經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)，是一種特色蜂蜜。本課題組前期研究了夏枯草蜂蜜的理化屬性，在動物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)夏枯草蜂蜜具有良好的抗結(jié)腸炎作用和對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，且多酚類物質(zhì)在其中發(fā)揮主要作用[11]。由于大孔樹脂提取的夏枯草蜂蜜提取物中包含了蜂蜜中絕大部分的多酚、黃酮類化合物等活性物質(zhì)，基本能反映夏枯草蜂蜜本身的功效，因而在本實(shí)驗(yàn)中采用大孔樹脂提取物進(jìn)行相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)擬從細(xì)胞、分子層面，建立硫酸葡聚糖（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)的腸細(xì)胞功能屏障損傷模型，以洋槐蜂蜜為對照，進(jìn)一步研究夏枯草蜂蜜對DSS誘導(dǎo)腸屏障損傷的保護(hù)作用，為夏枯草蜂蜜作為預(yù)防潰瘍性結(jié)腸炎功能食品的潛在應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

夏枯草蜂蜜、洋槐蜂蜜 河南駐馬店意大利蜜蜂場。

醋酸、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物、Prime ScriptTMRT Master Mix試劑盒、TB Green?Premix Ex TaqTM生工生物工程（上海）股份有限公司；甲醇、乙酸乙酯（色譜純） 美國MREDA公司；福林-酚試劑、青鏈霉素混合液（100×）、RNA提取試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；Amberlite XAD-2樹脂、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）溶液、2,2’-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）溶液、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 美國Sigma-Aldrich公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）美國Gibco Laboratories公司；DSS 美國MP Biomedicals公司；特異性抗體（依賴還原型輔酶/醌氧化還原酶（NAD(P)H quinone dehydrogenase，NQO）-1、核因子E2相關(guān)因子（nuclear factor-E2-related factor，Nrf）2、硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase，Txnrd）1）艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；特異性抗體（胞質(zhì)緊密黏連蛋白（zonula occludens，ZO）-1、β-肌動蛋白（β-actin）） 武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色劑 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；一抗稀釋液、二抗稀釋液 武漢賽博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-500超聲清洗儀 杭州法蘭特超聲波科技有限公司；SY-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；N-EVAP112氮?dú)獯蹈蓛x 美國OA-SYS公司；Spectra Max?I3酶標(biāo)儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；Nano Drop 2000超微量分光光度計(jì) 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；PCR儀 東勝創(chuàng)新生物科技（中國）有限公司；熒光定量PCR儀 杭州博中科技有限公司；恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；激光共聚焦掃描顯微鏡 德國Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 夏枯草蜂蜜、洋槐蜂蜜前處理

稱取夏枯草蜂蜜1 kg溶解在5 L、pH 2的醋酸中，充分?jǐn)嚢?.5 h后，將1 kg大孔樹脂（提前用無水乙醇浸泡24 h后，用清水洗凈）和蜂蜜溶液混合攪拌吸附1 h后，靜置分層，過夜，倒掉上清液后，將沉淀物裝入玻璃柱，依次用2 L、pH 2的醋酸和5 L去離子水淋洗，然后用7 L無水乙醇洗脫，收集洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至固形物后溶解于10 mL去離子水中，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，加入10 mL乙酸乙酯振蕩萃取10 min，收集乙酸乙酯層，重復(fù)4 次，合并后氮?dú)獯蹈桑糜?20 ℃冰箱保存，洋槐蜂蜜操作與夏枯草蜂蜜相同。

1.3.2 總酚酸、總黃酮含量測定

總酚酸含量的測定：采用福林-酚法[12]，在1.5 mL EP管中加入150 μL夏枯草蜂蜜提取液和等體積的福林-酚試劑，混勻后室溫避光反應(yīng)5 min，加入450 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的Na2CO3溶液，混勻，室溫避光反應(yīng)2 h之后，加入96 孔板中，200 μL/孔。設(shè)置3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1 個(gè)對照組（對照組中加入150 μL純水，其他處理與實(shí)驗(yàn)組相同），在765 nm波長處測定吸光度。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（y＝0.009 6x-0.003 1，R2＝0.993 0）。

總黃酮含量的測定：采用硝酸鋁法[12]，在1.5 mL EP管中加入150 μL夏枯草蜂蜜提取液、10 μL Al(NO3)3溶液（質(zhì)量濃度100 g/L）和10 μL CH5OOK溶液（質(zhì)量濃度9.8 g/L），漩渦混勻，加入330 μL去離子水，混勻后室溫靜置避光反應(yīng)1 h，加入96 孔板中，200 μL/孔。設(shè)置3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1 個(gè)對照組（對照組中加入150 μL純水，其他處理與實(shí)驗(yàn)組相同），在415 nm波長處測定吸光度。以槲皮素為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（y＝0.012 3x-0.007 8，R2＝0.998 7）。

1.3.3 抗氧化能力測定

1.3.3.1 ABTS陽離子自由基清除率和半抑制濃度測定

參考Yang Haisha等[13]的方法，在1.5 mL EP管中加入250 μL ABTS工作液和125 μL夏枯草蜂蜜提取物，漩渦混勻后避光反應(yīng)10 min，加入96 孔板中，150 μL/孔，在734 nm波長處測定實(shí)驗(yàn)組吸光度，記為A1；樣品空白對照組（125 μL DPPH溶液與125 μL無水乙醇溶液混合）記為A2；試劑空白對照組（125 μL無水乙醇溶液與125 μL樣品溶液混合）記為A0，按公式（1）計(jì)算ABTS陽離子自由基清除率。以水溶性VE（Trolox）為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、自由基清除率為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（y＝0.018 5x+0.153 8，R2＝0.995 4），計(jì)算蜂蜜半抑制濃度（50% maximum inhibiting concentration，IC50）。

1.3.3.2 DPPH自由基清除率和半抑制濃度測定

參考Guo Xiali等[14]的方法，配制質(zhì)量濃度1 mg/mL的DPPH標(biāo)準(zhǔn)液，稀釋合適倍數(shù)使其在517 nm波長處的吸光度保持在0.8～0.9。在1.5 mL EP管中加入125 μL夏枯草蜂蜜提取物和125 μL DPPH，室溫避光反應(yīng)0.5 h后，加入96 孔板中，100 μL/孔，在517 nm波長處測定實(shí)驗(yàn)組吸光度，記為A1；樣品空白對照組（250 μL ABTS工作液與150 μL無水乙醇溶液）記為A2；試劑空白對照組（250 μL ABTS工作液與150 μL無水乙醇溶液）記為A0，按公式（2）計(jì)算DPPH自由基清除率。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、自由基清除率為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（y＝0.008 0x+0.118 3，R2＝0.996 1），計(jì)算蜂蜜IC50。

1.3.3.3 鐵離子抗氧化能力和半抑制濃度測定

鐵離子抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）測定參考Guo Xiali等[14]的方法，在1.5 mL EP管中加入75 μL PBS（pH 6.6）、75 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% K3[Fe(CN)6]溶液和300 μL夏枯草蜂蜜提取物，漩渦混勻，50 ℃避光反應(yīng)20 min，加入75 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20% Cl3CCOOH溶液，2 000×g離心10 min，吸取300 μL上清液與300 μL去離子水，和60 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% FeCl3溶液充分混勻，于592 nm波長處測定吸光度，記為A1；以去離子水為空白對照，加入到96 孔板中，200 μL/孔，記為A2。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以其質(zhì)量濃度和清除率制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（y＝0.007 9x+0.386 2，R2＝0.995 2），計(jì)算蜂蜜IC50。

1.3.4 夏枯草蜂蜜提取物抗氧化活性及Caco-2細(xì)胞屏障功能完整性分析

1.3.4.1 Caco-2細(xì)胞相對活力測定

Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)條件：DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%體積分?jǐn)?shù)的熱滅活胎牛血清、質(zhì)量濃度100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素）；培養(yǎng)箱（37 ℃、相對濕度100%、體積分?jǐn)?shù)5% CO2）。將10×104個(gè)/mL Caco-2接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，邊緣加入100 μL DMEM高糖培養(yǎng)基為空白對照，待細(xì)胞完全分化且生長程度達(dá)到70%～80%時(shí)，進(jìn)行分組處理：夏枯草蜂蜜組：分別加入質(zhì)量濃度50、100、150 μg/mL和200 μg/mL的夏枯草蜂蜜提取物溶液；洋槐蜂蜜組：分別加入質(zhì)量濃度50、100、150 μg/mL和200 μg/mL的洋槐蜂蜜提取物溶液；空白對照組不做任何處理。孵育24 h后，加入CCK-8 10 μL/孔，置于培養(yǎng)箱中反應(yīng)2 h，在450 nm波長處測定吸光度。蜂蜜處理組吸光度記為A1、空白對照組記為A2，按公式（3）計(jì)算細(xì)胞相對活力，得出蜂蜜提取物安全質(zhì)量濃度。之后將10×104個(gè)/mL Caco-2接種于24 孔板中，待細(xì)胞完全分化且生長程度達(dá)到70%～80%時(shí)，進(jìn)行分組處理：夏枯草蜂蜜和洋槐蜂蜜組分別加入上述步驟所得蜂蜜提取物溶液的安全質(zhì)量濃度。孵育1 h后，夏枯草蜂蜜組、洋槐蜂蜜組和DSS組均加入體積分?jǐn)?shù)2.5% DSS，對照組不做任何處理。孵育24 h后，4 組均加入CCK-8溶液50 μL/孔，置于培養(yǎng)箱中反應(yīng)2 h，測定450 nm波長處的吸光度。夏枯草蜂蜜處理組記為A1，洋槐蜂蜜處理組記為A2，空白對照組記為A3，DSS處理組記為A4，同樣按公式（3）計(jì)算細(xì)胞相對活力。

式中：A代表A1或A2或A3。

1.3.4.2 單層Caco-2細(xì)胞膜電阻值測定

向6 孔板的小室中加入0.5 mL細(xì)胞懸浮液（細(xì)胞個(gè)數(shù)為10×104個(gè)），下室加入1.5 mL DMEM培養(yǎng)基，每2 d換一次液，測電阻值，培養(yǎng)到細(xì)胞電阻值不再變化，將細(xì)胞分為3 組，即空白組、DSS組和夏枯草蜂蜜提取物組?？瞻捉M不做任何處理，DSS組加入體積分?jǐn)?shù)2.5% DSS，夏枯草蜂蜜提取物預(yù)處理組加入質(zhì)量濃度100 μg/mL夏枯草蜂蜜提取物孵育1 h后再加入體積分?jǐn)?shù)2.5% DSS，處理后分別于0.25、0.75、1.75、3、5 h時(shí)測定電阻值[15]。

1.3.4.3 Caco-2細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1分布觀察

將10×104個(gè)/mL Caco-2細(xì)胞接種于6 孔板中，每孔中均放入爬片，37 ℃、相對濕度100%，體積分?jǐn)?shù)5% CO2，待細(xì)胞完全分化且生長程度達(dá)到50%左右時(shí)，加入質(zhì)量濃度100 μg/mL夏枯草蜂蜜提取物預(yù)處理1 h后，加入體積分?jǐn)?shù)2.5% DSS，24 h后收樣。用固定液（丙酮∶甲醇體積比為1∶1）固定0.5 h，0.5%聚乙二醇辛基苯基醚透化0.5 h，10%驢血清室溫封閉0.5 h后，體積比1∶200的一抗（ZO-1）稀釋液孵育1 h，體積比1∶500的二抗羊抗兔稀釋液孵育1 h，體積比1∶2 000的4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染核5 min，指甲油封片置于墨盒中，用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察并分析。

1.3.4.4 Caco-2細(xì)胞中抗氧化及緊密連接基因表達(dá)量的測定

檢測夏枯草蜂蜜提取物對DSS誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞中相關(guān)抗氧化蛋白基因（NQO-1、Txnrd1和Nrf2）和緊密連接蛋白基因ZO-1在mRNA水平的表達(dá)：將10×104個(gè)/mL Caco-2細(xì)胞接種于6 孔板中，待細(xì)胞完全分化且生長程度達(dá)到70%～80%后，加入適量不同質(zhì)量濃度的蜂蜜提取物預(yù)處理1 h，加入體積分?jǐn)?shù)2.5% DSS，孵育24 h后收樣。利用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，超微量分光光度計(jì)測定RNA濃度，RT Master Mix試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后放在-20 ℃冰箱保存待用。利用Premix ExTaqTM試劑盒做熒光定量PCR檢測，10 μL反應(yīng)體系（上游引物、下游引物和cDNA模板均為0.2 μL，Premix ExTaqTM5.0 μL，無RNA酶水4.4 μL）。以β-actin為管家基因，作靶標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)參照物，結(jié)果用2-ΔΔCt表示[16]，引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中的引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

1.3.4.5 Caco-2細(xì)胞蛋白提取及免疫印跡分析

將10×104個(gè)/mL Caco-2細(xì)胞接種于6 孔板中，待細(xì)胞完全分化且生長程度達(dá)到70%～80%之間，加入適量不同質(zhì)量濃度的蜂蜜提取物預(yù)處理1 h后，加入體積分?jǐn)?shù)5% DSS，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后收樣。取出細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)液，PBS清洗2 遍，每孔中加入80 μL NP-40細(xì)胞裂解液，在4 ℃搖床10 min，用細(xì)胞刮板刮下板內(nèi)細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，15 000×g、4 ℃離心10 min，取上清液。使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度檢測法測定蛋白質(zhì)量濃度，將剩余樣品和4×蛋白上樣緩沖液按體積比3∶1混合，15 000×g、4 ℃離心1 min，95 ℃水浴10 min，將變性后的蛋白放入-80 ℃冰箱待用。以20 μg總蛋白上樣量對不同處理蛋白進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體雜交、顯色等步驟，得到NQO-1、Nrf2、Txnrd1和β-actin基因的蛋白條帶。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Excel、Origin 2017軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和作圖，利用Image J軟件進(jìn)行免疫印跡結(jié)果分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性差異分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂蜜總酚酸、總黃酮含量測定結(jié)果

表2 兩種蜂蜜總酚酸、總黃酮含量Table 2 Contents of total flavonoids and total phenols in two honeys

由表2 可知， 夏枯草蜂蜜的總酚酸含量為（52.4±0.4）μg/g，極顯著高于洋槐蜂蜜的總酚酸含量（6.1±0.6）μg/g；夏枯草蜂蜜總黃酮含量為（7.0±0.3）μg/g，極顯著低于洋槐蜂蜜總黃酮含量（15.5±0.2）μg/g（P＜0.01）。

2.2 蜂蜜抗氧化能力測定結(jié)果

表3 兩種蜂蜜的抗氧化能力Table 3 Antioxidant activity of two honeys

由表3可知，夏枯草蜂蜜體外抗氧化活性顯著強(qiáng)于洋槐蜂蜜。夏枯草蜂蜜DPPH IC50、ABTS IC50和FRAP的IC50分別為（113.8±1.6）、（56.9±2.1）μg/g和（214.1±2.6）μg/g；而洋槐蜂蜜DPPH IC50、ABTS IC50和FRAP的IC50分別為（8.1±0.5）、（3.1±0.6）μg/g和（13.5±0.8）μg/g。

2.3 蜂蜜提取物對DSS誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞相對活力的影響

為保證蜂蜜提取物對Caco-2細(xì)胞生長代謝無明顯的毒性，采用CCK-8法測定質(zhì)量濃度0～200 μg/mL的夏枯草蜂蜜提取物、洋槐蜂蜜提取物對Caco-2細(xì)胞相對活力的影響。由圖1A可知，與空白對照組相比，Caco-2細(xì)胞經(jīng)過不同質(zhì)量濃度夏枯草蜂蜜提取物處理后，50～100 μg/mL的夏枯草蜂蜜提取物對細(xì)胞相對活力無顯著抑制效果（P＞0.05），而質(zhì)量濃度150～200 μg/mL的夏枯草蜂蜜提取物對Caco-2細(xì)胞的相對活力有顯著抑制作用（P＜0.05）。因此，將質(zhì)量濃度100 μg/mL作為夏枯草蜂蜜提取物的安全質(zhì)量濃度上限。如圖1B所示，與空白對照組相比，Caco-2細(xì)胞經(jīng)過不同質(zhì)量濃度洋槐蜂蜜提取物處理后，質(zhì)量濃度50～100 μg/mL的洋槐蜂蜜提取物對細(xì)胞相對活力無顯著抑制效果（P＞0.05），而質(zhì)量濃度150～200 μg/mL的洋槐蜂蜜提取物對Caco-2細(xì)胞相對活力有顯著的抑制作用（P＜0.05）。因此，質(zhì)量濃度100 μg/mL為洋槐蜂蜜提取物的安全質(zhì)量濃度上限。由圖1C可知，相比DSS損傷組（僅添加2.5% DSS），用質(zhì)量濃度50～100 μg/mL夏枯草蜂蜜提取物處理細(xì)胞，可以顯著提高Caco-2細(xì)胞的相對活力（P＜0.05），并可拮抗DSS對Caco-2細(xì)胞的損傷。由圖1D可知，相比DSS損傷組，洋槐蜂蜜處理對Caco-2細(xì)胞的相對活力無顯著提升（P＞0.05）。因此選擇夏枯草蜂蜜提取物為研究對象，評價(jià)其對DSS誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞基因和蛋白表達(dá)情況影響。

圖1 夏枯草蜂蜜提取物和洋槐蜂蜜提取物對DSS誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞相對活力的影響Fig. 1 Effect of Prunella vulgaris honey extract and acacia honey extract on Caco-2 cell viability with and without DSS induction

2.4 夏枯草蜂蜜提取物對細(xì)胞抗氧化及緊密連接基因相對表達(dá)量的影響

由圖2 A ～C 可知，與空白組相比，D S S 組顯著上調(diào)3 種抗氧化基因的相對表達(dá)量，質(zhì)量濃度50～100 μg/mL夏枯草蜂蜜提取物預(yù)處理組與DSS組相比，可顯著顯著上調(diào)3 種基因的相對表達(dá)量（P＜0.05，P＜0.01）。圖2D中，與空白對照組相比，DSS組下調(diào)了ZO-1的相對表達(dá)量，質(zhì)量濃度50～100 μg/mL夏枯草蜂蜜提取物預(yù)處理組與DSS組相比，可極顯著上調(diào)ZO-1的相對表達(dá)量（P＜0.01）。

圖2 夏枯草蜂蜜提取物對DSS誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞中抗氧化和緊密連接基因相對表達(dá)量的影響Fig. 2 Effect of PVH extract on the expression of antioxidant genes and tight junction gene in DSS-induced Caco-2 cells

2.5 夏枯草蜂蜜提取物對Caco-2細(xì)胞屏障功能的影響

Caco-2 單層細(xì)胞旁路中，因有離子流動而產(chǎn)生微弱電流。研究發(fā)現(xiàn)，單層細(xì)胞跨膜電阻值（transepithelial electrical resistance，TEER）越大（約500～1 500 Ω·cm2），緊密連接越完整，細(xì)胞屏障功能越強(qiáng)[17]。如圖3所示，空白組的電阻值沒有明顯變化，DSS組電阻值明顯降低，加入體積分?jǐn)?shù)2.5% DSS后3 h內(nèi)，電阻值基本穩(wěn)定，最大下降了12.8%，在5 h時(shí)，電阻值最大下調(diào)約20.0%；而在添加體積分?jǐn)?shù)2.5% DSS之前加入質(zhì)量濃度100 μg/mL夏枯草蜂蜜提取物預(yù)處理1 h，測得電阻值的下調(diào)幅度比DSS組小，加入體積分?jǐn)?shù)2.5% DSS的3 h內(nèi)，電阻值基本穩(wěn)定，最大下降了9.1%，在5 h時(shí)，電阻值最大下調(diào)11.1%。說明夏枯草蜂蜜提取物預(yù)處理可上調(diào)DSS誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞的電阻值，增強(qiáng)腸道屏障功能。

圖3 夏枯草蜂蜜提取物對DSS誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞單層跨膜電阻值的影響Fig. 3 Effect of PVH extract on TEER in DSS-induced Caco-2 cells

2.6 夏枯草蜂蜜提取物對Caco-2細(xì)胞ZO-1分布的影響

利用免疫熒光技術(shù)檢測Caco-2細(xì)胞中緊密連接蛋白的分布，結(jié)果如圖4所示，空白組緊密連接蛋白ZO-1分布完整，DSS組明顯破壞了緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)，而夏枯草蜂蜜提取物和DSS組緊密連接蛋白ZO-1的完整性明顯高于DSS組，說明夏枯草蜂蜜預(yù)處理可在一定程度上拮抗DSS對Caco-2細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1的損傷。

圖4 夏枯草蜂蜜提取物對DSS誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞緊密連接蛋白分布的影響Fig. 4 Effect of PVH extract on the distribution of tightly connected protein in DSS-induced Caco-2 cells

2.7 夏枯草蜂蜜提取物對DSS誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞抗氧化蛋白表達(dá)的影響

利用Western blot技術(shù)，檢測Caco-2細(xì)胞中抗氧化蛋白的表達(dá)，結(jié)果如圖5A所示，定量后的結(jié)果如圖5B～D所示。與空白組相比，DSS組上調(diào)了3 種蛋白的相對表達(dá)量。加入質(zhì)量濃度50～100 μg/mL夏枯草蜂蜜提取物預(yù)處理后，與DSS組相比，可顯著上調(diào)NQO-1蛋白的相對表達(dá)量（圖5B）（P＜0.05，P＜0.01）。加入質(zhì)量濃度100 μg/mL夏枯草蜂蜜提取物預(yù)處理后，與DSS組相比，可極顯著上調(diào)Nrf2蛋白的相對表達(dá)量（P＜0.01）（圖5C）。加入質(zhì)量濃度100 μg/mL夏枯草蜂蜜提取物預(yù)處理后，與DSS組相比，夏枯草蜂蜜組顯著上調(diào)Txnrd1蛋白的相對表達(dá)量（P＜0.05）（圖5D）。

圖5 夏枯草蜂蜜提取物對抗氧化蛋白相對表達(dá)量的影響Fig. 5 Effect of PVH extract on the expression of antioxidant proteins in DSS-induced Caco-2 cells

3 討 論

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，夏枯草蜂蜜在動物實(shí)驗(yàn)中具有良好的抗結(jié)腸炎作用，而且夏枯草蜂蜜含有豐富的多酚類物質(zhì)，主要包括迷迭香酸、p-香豆酸、香草酸、反式肉桂酸和咖啡酸等[12]。大量研究表明，多酚類化合物具有良好的生物學(xué)活性[18]，如一些多酚類成分可調(diào)節(jié)腸道上皮細(xì)胞屏障功能，促進(jìn)ZO-1等相關(guān)基因的表達(dá)[19]，而多酚類化合物亦可通過釋放一個(gè)電子或氫原子中和自由基，發(fā)揮其抗氧化活性[20]。

在以往研究中，Li Qiangqiang等[21]發(fā)現(xiàn)加入質(zhì)量濃度50～200 μg/mL花粉多酚提取物預(yù)處理的細(xì)胞活力顯著高于DSS組，說明蜂花粉對DSS誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞損傷有潛在的保護(hù)作用。在本研究中，夏枯草蜂蜜提取物在質(zhì)量濃度50～100 μg/mL處理細(xì)胞，相比DSS損傷組，可以顯著提高Caco-2細(xì)胞的相對活力（P＜0.05），拮抗DSS對Caco-2細(xì)胞的損傷，而洋槐蜂蜜并無顯著作用（P＞0.05），說明夏枯草蜂蜜提取物對DSS誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞損傷有潛在的保護(hù)作用。

體外研究表明，酚酸類化合物具有羥基基團(tuán)，可以有效清除自由基[22]。本研究結(jié)果表明，夏枯草蜂蜜的總酚酸含量極顯著高于洋槐蜂蜜，總黃酮含量極顯著低于洋槐蜂蜜（P＜0.01），而梁馨文等[23]研究發(fā)現(xiàn)海南無刺蜂蜂蜜總黃酮含量（16.1±0.3）μg/g高于夏枯草蜂蜜。但3 種蜂蜜的體外抗氧化能力從高到低依次為夏枯草蜂蜜＞無刺蜂蜂蜜＞洋槐蜂蜜。由此看來，盡管多酚類物質(zhì)對蜂蜜抗氧化能力起主要貢獻(xiàn)，但具有更高含量的酚酸和黃酮類物質(zhì)的蜂蜜不一定具有更高的抗氧化能力，這也可能與蜂蜜中多酚類物質(zhì)種類有關(guān)[24]。

前人研究證明DSS誘導(dǎo)的單層Caco-2細(xì)胞與結(jié)腸炎的早期炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[25-26]，一定濃度的外源性DSS加入Caco-2單層細(xì)胞中，可導(dǎo)致緊密連接蛋白損傷、上皮屏障功能障礙、腸細(xì)胞膜通透性增加等炎癥性疾病[27-30]。緊密連接蛋白的表達(dá)和分布是決定腸屏障功能穩(wěn)定性及完整性的主要因素。細(xì)胞緊密連接蛋白主要是由連接黏附因子、occludin、claudins和閉合小環(huán)蛋白（ZO-1、ZO-2、ZO-3）等組成[31]。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)緊密連接功能紊亂會增加細(xì)胞膜的滲透性，從而使某些有毒物質(zhì)（毒素和細(xì)菌等）進(jìn)入腸道黏膜固有層激活免疫細(xì)胞，進(jìn)而引發(fā)胃腸道疾病等疾病[32-33]。Caco-2細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能與人的小腸上皮細(xì)胞類似，在緊密連接和細(xì)胞極性等方面有共通性，被廣泛應(yīng)用于研究體內(nèi)腸轉(zhuǎn)運(yùn)模型[34]和腸道上皮細(xì)胞的屏障功能[35]。

本實(shí)驗(yàn)利用細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)研究夏枯草蜂蜜對Caco-2細(xì)胞的屏障功能的影響（圖3），空白組的電阻值沒有明顯變化，DSS組中，電阻值明顯降低，這與以往研究結(jié)果一致[21,36]；而在加入體積分?jǐn)?shù)2.5% DSS前1 h加入質(zhì)量濃度100 μg/mL夏枯草蜂蜜提取物預(yù)處理，電阻值的下調(diào)幅度明顯比DSS組小，說明在一定程度上，夏枯草蜂蜜提取物預(yù)處理可以上調(diào)Caco-2細(xì)胞的電阻值，加強(qiáng)腸道屏障功能，改善DSS對Caco-2細(xì)胞屏障功能的損傷。為驗(yàn)證此猜想，本研究進(jìn)一步從基因及蛋白層面深入探索。DSS組中ZO-1相對表達(dá)量降低，而夏枯草蜂蜜提取物預(yù)處理組相比于DSS組，ZO-1表達(dá)極顯著增強(qiáng)（P＜0.01）（圖2D）。與空白組相比，DSS刺激組明顯破壞了細(xì)胞ZO-1蛋白的完整性，而夏枯草蜂蜜提取物預(yù)處理組則表現(xiàn)出相對完整的緊密連接結(jié)構(gòu)（圖4）。在以往研究中發(fā)現(xiàn)富含多酚的食物，如綠茶、水果等可以改善腸道屏障功能[37-39]。Li Qiangqiang等[21]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過質(zhì)量濃度50～100 μg/mL蜂花粉多酚提取物預(yù)處理的細(xì)胞中，ZO-1表達(dá)顯著增強(qiáng)，細(xì)胞也表現(xiàn)出相對完整的緊密連接結(jié)構(gòu)。本研究與其結(jié)果一致，說明夏枯草蜂蜜提取物可維持Caco-2細(xì)胞緊密連接的完整性，增強(qiáng)腸道屏障功能，改善DSS對Caco-2細(xì)胞屏障功能的損傷。

Poritz等[40]發(fā)現(xiàn)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎最早的癥狀之一就是緊密連接蛋白的損傷，其次是細(xì)胞通透性增加，進(jìn)而導(dǎo)致腸道氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)。氧化應(yīng)激過程會產(chǎn)生活性氧，活性氧和腸上皮黏膜的巰基反應(yīng)使相應(yīng)酶失活和蛋白質(zhì)變性，與細(xì)胞膜內(nèi)多不飽和脂肪酸反應(yīng)，促使脂質(zhì)過氧化，加劇腸道細(xì)胞損傷[41]。NQO-1、Txnrd1及Nrf2蛋白參與細(xì)胞對氧化應(yīng)激的防御，且參與增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力的過程[42-44]。Nrf2是轉(zhuǎn)錄因子的一種，一般情況下，keap1可迅速降解Nrf2，氧化應(yīng)激條件下，激活Nrf2的表達(dá)，抗氧化反應(yīng)原件和Nrf2結(jié)合，促使調(diào)控特定抗氧化蛋白的基因和細(xì)胞防御酶的表達(dá)，從而有效降低活性氧物質(zhì)對細(xì)胞的損傷程度，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[45]。NQO-1是啟動抗氧化反應(yīng)原件相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵基因，通過催化醌類和其衍生物發(fā)生還原反應(yīng)，進(jìn)而有效抑制ROS產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗氧化作用[46]。Txnrd1是Nrf2-keap1應(yīng)答系統(tǒng)有效的調(diào)節(jié)器[47]，可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控NADPH氧化酶的活性，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。正常狀態(tài)下，胞內(nèi)為還原態(tài)，胞外為氧化態(tài)，氧化應(yīng)激改變了細(xì)胞的內(nèi)外狀態(tài)，而過度氧化應(yīng)激會使細(xì)胞產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的損傷，因此細(xì)胞會增加Txnrd1水平從而消除H2O2，抑制細(xì)胞凋亡，幫助細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激。DSS誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞中抗氧化基因的表達(dá)，觸發(fā)細(xì)胞防御保護(hù)機(jī)制，細(xì)胞免疫應(yīng)答，釋放出更多的抗氧化因子抵抗氧化應(yīng)激。而夏枯草蜂蜜提取物預(yù)處理與DSS組相比，Txnrd1基因表達(dá)極顯著增強(qiáng)（P＜0.01），NQO-1和Nrf2基因表達(dá)顯著增強(qiáng)（P＜0.05），說明夏枯草蜂蜜提取物使細(xì)胞釋放出更多的抗氧化因子來抵抗DSS對Caco-2細(xì)胞的氧化損傷，從而能夠有效保護(hù)細(xì)胞。DSS組促進(jìn)了3 種蛋白的相對表達(dá)量，說明DSS誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞中抗氧化蛋白的表達(dá)，觸發(fā)了細(xì)胞防御保護(hù)機(jī)制，而在夏枯草蜂蜜提取物預(yù)處理組中，尤其是質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，Txnrd1、NQO-1、Nrf2蛋白相對表達(dá)顯著增強(qiáng)（P＜0.05，P＜0.01），說明夏枯草蜂蜜提取物促使細(xì)胞釋放出更多的抗氧化因子來抵抗DSS對Caco-2細(xì)胞的氧化損傷。

綜上，與洋槐蜂蜜相比，夏枯草蜂蜜對DSS損傷的Caco-2細(xì)胞有保護(hù)作用。夏枯草蜂蜜提取物可以上調(diào)抗氧化基因（NQO-1、Txnrd1和Nrf2）和緊密連接蛋白基因（ZO-1）的相對表達(dá)量，上調(diào)抗氧化蛋白（NQO-1、Txnrd1和Nrf2）的相對表達(dá)量，維持Caco-2細(xì)胞緊密連接的完整性，增強(qiáng)腸道屏障功能，改善DSS對Caco-2細(xì)胞屏障功能的損傷。這些結(jié)果為探明夏枯草蜂蜜對腸道健康的有益作用的機(jī)制提供了支持，并對潰瘍性結(jié)腸炎的預(yù)防和治療具有重要參考價(jià)值。