海洋細菌基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)庫的建立

李艷君，丁毅偉，趙強元，馬 聰

解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心 檢驗科，北京 100048

海洋細菌廣泛分布于海洋環(huán)境中，可通過多種途徑引發(fā)嚴(yán)重感染，如食用污染海產(chǎn)品引發(fā)的細菌性食物中毒、海水浸泡引發(fā)的傷口感染等[1-3]。從軍事角度來看，戰(zhàn)傷合并海水浸泡可能引起傷口細菌感染，給傷員救治帶來一定難度，病原菌的快速鑒定對于感染的診治至關(guān)重要。近年來基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS) 突破傳統(tǒng)方法鑒定耗時長、鑒定能力不足等弊端，在臨床得以廣泛應(yīng)用[4-7]。然而，在實際應(yīng)用中我們發(fā)現(xiàn)，對于海洋細菌這一類特殊群體，MALDI-TOF MS 存在鑒定能力不足的問題，其主要的原因是儀器商品化的數(shù)據(jù)庫包含的海洋細菌菌種資源較少，缺少可供鑒定比對的數(shù)據(jù)。本研究通過收集海洋環(huán)境來源細菌，建立本地化海洋細菌MALDI-TOF MS 鑒定數(shù)據(jù)庫，目的在于提高海洋細菌的鑒定能力，從而為海洋細菌引起的各類感染性疾病的快速診斷和治療提供幫助。

材料與方法

1 樣本來源 本中心課題組選取2006 - 2016 年分離保存的國內(nèi)外6 大海域158 個采樣點海洋細菌530 株( 表1)，其中430 株用于構(gòu)建數(shù)據(jù)庫，100 株用于驗證數(shù)據(jù)庫鑒定能力。所有凍存菌株甘油保存液復(fù)溫后以三區(qū)劃線方式接種至哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)24 h，獲得純培養(yǎng)細菌菌落。

表1 用于自建庫海洋細菌來源信息Tab. 1 Source information of marine bacteria for in-house database construction

2 儀器與試劑 德國Bruker 公司的Microflex 系列MALDI-TOF 質(zhì)譜儀及配套分析軟件FlexControl 3.4、Biotyper 3.1 和Flexanalysis3.1 ；美國ABI 梯度PCR 儀；質(zhì)譜儀配套甲酸及基質(zhì)液；Sigma 公司細菌DNA 提取試劑盒、PCR 反應(yīng)試劑，法國梅里埃哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基。

3 基于16srDNA 測序的菌種鑒定 純培養(yǎng)菌落用商品化試劑盒提取全基因組DNA，16srDNA 擴增通用引物序列為27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3'和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，反應(yīng)體系為30 μl(DNA 模板1μl，上下游引物各3μl，Buffer 3μl，dNTP 2μl，Taq 酶0.2μl，水17.8μl) ；擴增條件為95℃ 5 min，(95℃ 30 s，56℃ 40 s，72℃ 1 min)×30 循環(huán)，72℃ 10 min。擴增產(chǎn)物上機測序，序列結(jié)果登錄國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI) 網(wǎng)站進行比對，明確菌種。

4 蛋白譜圖的采集 純培養(yǎng)菌落應(yīng)用甲酸萃取法提取蛋白，吸取1μl 上清，滴加到MALDI 靶板上，每株菌制備到8 個靶位，晾干后滴加HCCA 基質(zhì)溶液，干燥后上機檢測。打開FlexControl 3.4 軟件采集譜峰：每個靶位采圖3 張，每張圖轟擊100次激光，將獲得的24 張圖譜在Flexanalysis 3.1 中打開，除去低質(zhì)量的圖譜。將＞20 張的有效圖譜在Biotyper 3.1 中打開，( 若＜20 張則重復(fù)試驗)，按照16srDNA 測序鑒定結(jié)果輸入菌株名稱，指定路徑和目錄完成建庫過程。

5 數(shù)據(jù)庫的驗證 以16srDNA 測序鑒定結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，待鑒定海洋細菌分別用商品化數(shù)據(jù)庫、自建數(shù)據(jù)庫和擴展數(shù)據(jù)庫( 商品庫+ 自建庫) 進行菌種鑒定，與16srDNA 測序鑒定結(jié)果一致則為鑒定正確，并記錄鑒定分值，其判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：＞2.0 分，為確定種水平的鑒定，可能的種水平鑒定；1.7 ～1.999 分，為可能的屬水平鑒定；＜1.7 為不可靠的鑒定。

6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件對不同數(shù)據(jù)庫的鑒定正確率進行統(tǒng)計分析，觀測資料主要是計數(shù)資料，以例數(shù)及率表示，組間比較采用χ2檢驗。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與16srDNA測序鑒定結(jié)果一致定義為鑒定正確。

結(jié) 果

1 自建海洋細菌數(shù)據(jù)庫菌種信息及質(zhì)譜圖容量430 株菌經(jīng)16srDNA 擴增測序后，9 株菌出現(xiàn)雙峰或測序失敗，故421 株菌用于構(gòu)建數(shù)據(jù)庫。自建數(shù)據(jù)庫共包括了32 個菌屬、82 個菌種、421 株細菌的質(zhì)譜圖，菌株詳細信息見表2。

2 驗證菌株來源與種類 從本課題組前期保存的海洋細菌庫中隨機選取海洋菌株100 株用于數(shù)據(jù)庫驗證，除1 株測序失敗外，其余99 株經(jīng)16srDNA測序獲得菌種鑒定結(jié)果( 表3)，涵蓋12 個菌屬，29 個菌種，菌株種類的多樣性有助于獲得可靠的數(shù)據(jù)庫驗證結(jié)果。

3 各數(shù)據(jù)庫鑒定準(zhǔn)確率比較 分別用商品化數(shù)據(jù)庫、自建數(shù)據(jù)庫和擴展數(shù)據(jù)庫對99 株菌株進行菌種鑒定，鑒定結(jié)果與16srDNA 測序一致時判斷為鑒定正確，擴展數(shù)據(jù)庫的鑒定準(zhǔn)確率優(yōu)于儀器自帶的商品化數(shù)據(jù)庫(98% vs 80%，P ＜0.001)。見表4。

討 論

海洋細菌是海洋環(huán)境中分布最廣、數(shù)量最大的一類微生物，其種類繁多，可通過各種途徑引起人類相關(guān)感染，診治不及時可危及生命[8-11]。海上作業(yè)人員是海洋細菌感染的高危人群，尤其是隨著海軍艦艇編隊走向深藍，海軍官兵接觸海洋細菌機會增多，引起相關(guān)感染風(fēng)險增大，如食用被海洋細菌污染的食物導(dǎo)致腸道感染，治療不及時可能引起群體性發(fā)病，影響任務(wù)執(zhí)行力。此外某些種類的海洋細菌可通過破損的皮膚引起組織嚴(yán)重感染[12]，尤其是在戰(zhàn)爭條件下，傷員落水可能引起海洋細菌較為嚴(yán)重的感染，影響戰(zhàn)斗力。因此對于海洋細菌引起相關(guān)感染的快速診斷和治療至關(guān)重要。目前病原菌鑒定多采用傳統(tǒng)的生化反應(yīng)方法，操作煩瑣且耗時，而分子生物學(xué)鑒定僅局限于少數(shù)已知特異性序列的細菌，覆蓋面窄。近年來MALDI-TOF MS 突破傳統(tǒng)方法鑒定耗時長、鑒定能力不足等弊端，在臨床得以廣泛應(yīng)用[13-15]。然而實際應(yīng)用中MALDI-TOF MS 存在對海洋細菌鑒定能力不足的問題，主要是數(shù)據(jù)庫資源有限。有研究報道通過擴展數(shù)據(jù)庫可提高某些目的菌種的鑒定能力[16-19]，本研究對海洋細菌MALDI-TOF MS 數(shù)據(jù)庫的鑒定能力進行了驗證。

表2 自建數(shù)據(jù)庫菌種信息Tab. 2 Species information of in-house database

本研究利用菌株的資源優(yōu)勢建立的本地化海洋細菌MALDI-TOF MS 鑒定數(shù)據(jù)庫，共包含32 個菌屬、82 個菌種、421 株細菌質(zhì)譜圖。與商品化數(shù)據(jù)庫相比，自建數(shù)據(jù)庫新增了9 個菌屬、22 個菌種、73 株菌的質(zhì)譜圖。新增菌屬包括食烷菌、德庫菌、大洋單胞菌、大洋桿菌、鞘氨醇桿菌、萊茵海默氏菌、固氮螺菌、卓貝爾氏菌和硝酸鹽還原菌。自建數(shù)據(jù)庫不僅在數(shù)量上豐富了商品化數(shù)據(jù)庫，在菌株種類上，商品化數(shù)據(jù)庫部分菌株來源于標(biāo)準(zhǔn)菌株，而自建數(shù)據(jù)庫中的菌種均來源于海洋環(huán)境，更加貼近海洋細菌的鑒定需求。

表3 99 株用于數(shù)據(jù)庫驗證的菌株信息Tab. 3 Information of 99 strains used for database validation

表4 自建數(shù)據(jù)庫與商品化數(shù)據(jù)庫鑒定率比較Tab. 4 Comparison of identification rates of in-house and commercial databases

我們對自建數(shù)據(jù)庫的鑒定能力進行了驗證，99 株菌分別用自建數(shù)據(jù)庫、商品化數(shù)據(jù)庫和擴展數(shù)據(jù)庫進行菌種鑒定，通過與金標(biāo)準(zhǔn)16srDNA 鑒定結(jié)果進行比對，原商品化數(shù)據(jù)庫鑒定的正確率為80.8%。從鑒定分值來看，＞2.0 的只有44 株菌，＜1.7 的有5 株，盡管這5 株菌鑒定結(jié)果正確，但按照判斷標(biāo)準(zhǔn)，＜1.7 的鑒定結(jié)果是不可信的，因此應(yīng)用商品化數(shù)據(jù)庫進行99 株菌的鑒定，只有75 株菌得到可靠的鑒定結(jié)果。自建數(shù)據(jù)庫的鑒定正確率達到96.0%，94 株菌得到可靠的鑒定結(jié)果。擴展數(shù)據(jù)庫的鑒定正確率高達98.0%，96 株菌得到可靠的鑒定結(jié)果。

研究中我們發(fā)現(xiàn)，即便是待鑒定菌株的種類存在于商品化數(shù)據(jù)庫中，也難以與庫中的譜圖很好地匹配。如分離率較高、在海水環(huán)境中較為常見的溶藻弧菌，12 株中3 株錯誤鑒定為副溶血弧菌和需鈉弧菌，其余9 株鑒定分數(shù)為1.7 ～ 1.99。分析原因可能是菌株的培養(yǎng)方式不同以及數(shù)據(jù)庫中的菌種與待鑒定菌株之間地域來源不同，導(dǎo)致蛋白譜峰存在一定的差異，所以以各自實驗室常規(guī)方式進行菌株的培養(yǎng)和前處理，建立來源廣泛的菌株數(shù)據(jù)庫，將有助于提高MALDI-TOF MS 的海洋細菌鑒定能力。

綜上所述，本研究通過種類豐富的海洋細菌建立本地化的MALDI-TOF MS 鑒定數(shù)據(jù)庫，擴展了商品數(shù)據(jù)庫海洋細菌的種類和數(shù)量。經(jīng)驗證，擴展數(shù)據(jù)庫能夠提高海洋細菌的鑒定能力。之前未見建立此類數(shù)據(jù)庫的報道，本研究建立的海洋細菌鑒定數(shù)據(jù)庫可推廣應(yīng)用于普通民眾、海洋作業(yè)人員感染病原的鑒定，同時也為海軍官兵戰(zhàn)創(chuàng)傷引發(fā)海洋細菌感染的診治提供保障。