D-果糖對(duì)魯氏酵母菌生理特性及轉(zhuǎn)錄組學(xué)的影響

李 昕， 戴凌燕， 劉 紅，3， 鄧景致， 李志江，3，*， 張東杰，3， 王成濤

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院， 黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 黑龍江 大慶 163319；3.北大荒現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)省級(jí)培育協(xié)同創(chuàng)新中心， 黑龍江 大慶 163319；4.北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心， 北京 100048)

魯氏酵母菌(Zygosaccharomycesrouxii)是一種常見的耐高滲透壓酵母菌，可以在高糖或者高鹽的環(huán)境中生長(zhǎng)[1]。作為傳統(tǒng)的發(fā)酵菌種之一，魯氏酵母菌在發(fā)酵過程中代謝生成乙醇、芳香雜醇以及類似于焦糖味的呋喃酮類化合物而增強(qiáng)食品的風(fēng)味，是醬油和豆醬食品發(fā)酵過程中的重要微生物[2]。魯氏酵母菌在發(fā)酵過程中很容易受到環(huán)境因素影響，如鹽、糖以及酸脅迫等，魯氏酵母菌通過表達(dá)胞內(nèi)抗氧化酶系活性抵御鹽脅迫帶來的影響[3]。Liu等[4]研究表明，當(dāng)魯氏酵母菌受到糖脅迫時(shí)，細(xì)胞會(huì)通過調(diào)節(jié)自身微環(huán)境來緩解糖脅迫帶來的傷害。

國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)魯氏酵母菌的研究大多集中在發(fā)酵食品中的應(yīng)用，如魯氏酵母菌對(duì)豆醬或醬油風(fēng)味的提升，以及對(duì)面包品質(zhì)和香腸加工工藝的影響[5-6]，但對(duì)其在鹽、糖等環(huán)境中的生長(zhǎng)特性及增香機(jī)制尚未完全揭示；國(guó)外學(xué)者研究的重點(diǎn)則集中于魯氏酵母菌的耐鹽機(jī)制，以及在高滲環(huán)境下魯氏酵母菌的生長(zhǎng)特性[7]，而在高糖環(huán)境下魯氏酵母菌生長(zhǎng)、代謝及相關(guān)基因表達(dá)方面研究較少。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn)，在D-果糖調(diào)控下，魯氏酵母菌發(fā)酵液呈現(xiàn)更好的風(fēng)味，推測(cè)糖調(diào)控促進(jìn)魯氏酵母菌代謝合成更多的風(fēng)味物質(zhì)；因此，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析，本研究進(jìn)一步探索D-果糖對(duì)魯氏酵母菌生理特性的影響，揭示其增香的分子機(jī)制，以期為魯氏酵母的發(fā)酵產(chǎn)香提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魯氏酵母菌，購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)為No.32899。NaCl，化學(xué)純，購(gòu)自天津大茂化學(xué)試劑公司；D-果糖，化學(xué)純，購(gòu)自上海源葉生物技術(shù)公司；YPD培養(yǎng)基，購(gòu)自青島希望生物技術(shù)有限公司；其他試劑均購(gòu)買于德國(guó)CNW科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ- QX型全溫空氣恒溫振蕩器，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；Centrifuge5430R型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)艾爾德股份公司；SW- CJ- 2G型超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；FE28- S型pH計(jì)，瑞士梅特勒- 托利多公司；1290 UHPLC型超高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；Triple TOF 6600型(配有Analyst TF 1.7軟件)高分辨質(zhì)譜儀，美國(guó)AB Sciex公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1魯氏酵母菌的培養(yǎng)

在250 mL三角瓶中裝入100 mL YPD液體培養(yǎng)基，接入5 mL的已活化好的菌液，在全溫振蕩器中28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)27 h。將培養(yǎng)后的菌液分別取出5 mL，放在100 mL YPD(含5 g YPD, 18 g NaCl)液體培養(yǎng)基中，命名為YPD對(duì)照組；放在100 mL YPD+Fru(含5 g YPD, 18 g NaCl, 12 g D-果糖)液體培養(yǎng)基中，命名為YPD+Fru實(shí)驗(yàn)組[8]。每個(gè)處理組進(jìn)行3次生理重復(fù)實(shí)驗(yàn)，分別培養(yǎng)0、3、5、7 d。

1.3.2D-果糖對(duì)魯氏酵母菌生理特性影響指標(biāo)的測(cè)定

取10 mL菌液于4 800 r/min離心15 min，棄去上清液，再加蒸餾水至10 mL，再次離心15 min。重復(fù)操作3次。將離心后的菌體用YPD培養(yǎng)基定容至10 mL，搖勻后，用1 cm比色皿測(cè)定在600 nm下的OD值。取5 mL發(fā)酵液樣品，用pH計(jì)測(cè)定pH值。采用血球計(jì)數(shù)法測(cè)定魯氏酵母菌數(shù)量[8]。

1.3.3魯氏酵母菌發(fā)酵液代謝物含量的測(cè)定

取100 μL樣本，加入400 μL含有2-氯苯丙氨酸的提取液(甲醇、乙腈體積比為1∶1，2-氯苯丙氨酸質(zhì)量濃度為2 μg/mL)，渦旋混勻30 s，超聲5 min(冰水浴)，零下20 ℃靜置1 h。將樣本于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取425 μL上清液于EP管中，在真空濃縮器中干燥提取物。向干燥后的代謝物中加入100 μL 水復(fù)溶，渦旋30 s，冰水浴超聲10 min。將樣本于4 ℃，12 000 r/min離心15 min，取出60 μL上清液于2 mL進(jìn)樣瓶，每個(gè)樣本各取10 μL混合成QC(quality control)樣本，再取60 μL上機(jī)檢測(cè)[9]。

1.3.4魯氏酵母菌轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)定與分析

1.3.4.1 RNA提取

將培養(yǎng)好的魯氏酵母菌懸液于4 ℃條件下，12 000 r/min離心3 min，棄上清液后置于離心管(千分之一濃度的DEPC水處理)，放入液氮中，待菌體凝固后倒入預(yù)冷好的研缽中進(jìn)行研磨。將菌體研磨為白色粉末，并轉(zhuǎn)移到1.5 mL Eppendorf管中。采用Trizol法進(jìn)行RNA提取，并對(duì)總RNA的質(zhì)量初步鑒定，包括瓊脂糖凝膠電泳分析RNA降解程度，以及是否有污染和Nanodrop檢測(cè)RNA的純度(以O(shè)D260/OD280表示)[10]。

1.3.4.2 魯氏酵母菌轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的構(gòu)建

將提取的RNA用帶有Oligo(dT)的磁珠，通過A- T互補(bǔ)配對(duì)與mRNA的ployA尾結(jié)合的方式，富集真核生物mRNA。加入fragmentation buffer，將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物(random hexamers)合成一鏈cDNA；加入緩沖液dNTPs和DNA polymerase I。合成二鏈cDNA，隨后利用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)，加A尾并連接測(cè)序接頭，用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR富集得到最終的cDNA文庫(kù)。測(cè)序的平臺(tái)為上海中科新生命生物科技有限公司，并由該公司提供技術(shù)服務(wù)。

1.3.4.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

將過濾后得到的Clean reads通過HISAT軟件進(jìn)行基因組定位分析，使用HTSeq軟件對(duì)樣品進(jìn)行基因表達(dá)水平分析，模型為union[11]。結(jié)果文件分別統(tǒng)計(jì)了不同表達(dá)水平下基因的數(shù)量以及單個(gè)基因的表達(dá)水平。一般情況下，將FPKM(fragments per kilobase million)數(shù)值為0.1或者1作為判斷基因是否表達(dá)的閾值。根據(jù)需求，利用DEGseq(differentially expressed genes)方法對(duì)基因差異表達(dá)的水平進(jìn)行DEGs檢測(cè)。將差異倍數(shù)Fold Change≥2，并且Q-value≤0.001的基因定義為顯著性差異表達(dá)基因。GO(gene ontology)富集分析采用的軟件方法為GOseq[12]。Pathway顯著性富集分析以KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)中Pathway為單位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景相比，在差異表達(dá)基因中顯著性富集的Pathway。FDR(false discovery rate)≤0.05時(shí)，表示差異基因在該P(yáng)athway中顯著富集，并利用KOBAS 2.0軟件進(jìn)行Pathway富集分析。計(jì)算方法如式(1)。

(1)

式(1)中：P，表示概率；N，所有基因中具有Pathway注釋的基因數(shù)目；n，N中差異表達(dá)基因的數(shù)目；M，所有基因中注釋為某特定Pathway的基因數(shù)目；m，注釋為某特定Pathway的差異表達(dá)基因數(shù)目。

1.4 數(shù)據(jù)處理

樣品處理和數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值。采用軟件SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以O(shè)neway ANOVA進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，并采用軟件GrapHPad Prism 8.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 D-果糖調(diào)控下魯氏酵母菌生長(zhǎng)情況

分別對(duì)比了在YPD和YPD+Fru處理組中魯氏酵母菌的生長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖1。魯氏酵母菌在添加了D-果糖的培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)情況顯著優(yōu)于在YPD中培養(yǎng)的魯氏酵母菌。隨著發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行到3 d，處理組中魯氏酵母菌的OD和細(xì)胞菌數(shù)極顯著高于YPD對(duì)照組(P<0.001)，說明在YPD培養(yǎng)基中添加D-果糖有利于魯氏酵母菌生長(zhǎng)。姜威等[13]的研究也表明，以糖為碳源時(shí)，有利于酵母菌生長(zhǎng)，代謝產(chǎn)物增加。研究結(jié)果表明，向YPD培養(yǎng)基中添加D-果糖對(duì)魯氏酵母菌細(xì)胞的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

*** 表示差異極顯著(P<0.001)。圖1 D-果糖調(diào)控對(duì)魯氏酵母細(xì)胞OD值和細(xì)胞菌數(shù)的影響Fig.1 Effects of D-fructose regulation on OD value and numbers of Zygosaccharomyces rouxii

2.2 D-果糖調(diào)控下魯氏酵母菌發(fā)酵液pH值的變化

*** 表示差異極顯著(P<0.001)。圖2 D-果糖調(diào)控對(duì)魯氏酵母菌發(fā)酵液pH值的影響Fig.2 Effect of D-fructose regulation on pH value of Zygosaccharomyces rouxii fermentation broth

2.3 D-果糖調(diào)控下魯氏酵母菌發(fā)酵液中揮發(fā)性物質(zhì)變化

魯氏酵母菌添加到豆醬中可顯著提高產(chǎn)品的感官品質(zhì)和理化品質(zhì)，拓展其在發(fā)酵食品中應(yīng)用[2]。在發(fā)酵后期，YPD+Fru組香味明顯高于對(duì)照組，呈現(xiàn)典型的醬香風(fēng)味。本研究對(duì)兩組發(fā)酵液進(jìn)行了LC- MS/MS分析，揮發(fā)性物質(zhì)測(cè)定結(jié)果如表1。在酸類物質(zhì)中，YPD+Fru組中丙酮酸的含量顯著高于YPD組。丙酮酸在糖酵解代謝通路中起著重要作用，也是糖酵解與三羧酸循環(huán)之間的紐帶，代表了D-果糖在代謝過程中的碳流走向[19]。丙酮酸具有醋酸香氣和愉快的酸味，具有很好的防腐保鮮功能[20]。丙三醇能抑制底物和產(chǎn)物中的細(xì)菌，保護(hù)細(xì)胞抵抗脅迫[21]。甲酸乙酯有果香味，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到第5天時(shí)，甲酸乙酯的含量顯著高于對(duì)照組。呋喃酮是一種焦糖味的化合物，在菠蘿、草莓[22]和芒果[23]中均有發(fā)現(xiàn)。在發(fā)酵進(jìn)行第5天時(shí)，YPD+Fru組中呋喃酮的含量均高于YPD組，表明D-果糖有利于魯氏酵母菌代謝合成更多的呋喃酮。碘苯酚的氣味略微有刺激性，添加D-果糖后，YPD+Fru組中碘苯酚的含量低于對(duì)照組，推測(cè)D-果糖對(duì)有刺激性的氣體有一定的抑制作用。在檢測(cè)到的揮發(fā)物中，酸類物質(zhì)占比較大，說明添加D-果糖對(duì)魯氏酵母菌發(fā)酵產(chǎn)酸影響較大。

表1 D-果糖調(diào)控的魯氏酵母菌揮發(fā)性物質(zhì)分析結(jié)果Tab.1 Analysis of volatile substances of Zygosaccharomyces rouxii after D-fructose regulation

倍數(shù)變化指兩種培養(yǎng)條件下發(fā)酵液中物質(zhì)相對(duì)定量的比值。

2.4 魯氏酵母菌差異表達(dá)基因分析結(jié)果

分析魯氏酵母差異表達(dá)基因數(shù)目，結(jié)果如表2。培養(yǎng)基中添加D-果糖的魯氏酵母菌經(jīng)發(fā)酵3 d后，7 469個(gè)基因的基因水平發(fā)生顯著變化(P<0.001)，其中，上調(diào)基因3 731個(gè)，下調(diào)基因3 738個(gè)；在發(fā)酵進(jìn)行5 d時(shí)，4 611個(gè)基因表達(dá)水平發(fā)生顯著變化(P<0.001)，其中2 216個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，2 395個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；發(fā)酵7 d時(shí)，對(duì)8 611個(gè)基因進(jìn)行了差異比較(P<0.001)，其中4 354個(gè)基因上調(diào)，4 257個(gè)基因下調(diào)。因此，D-果糖調(diào)控可引起魯氏酵母菌糖及其他代謝過程中基因的顯著變化，分析其具體變化情況有利于明確其增香機(jī)制。

表2 差異表達(dá)基因數(shù)目Tab.2 Numbers of differentially expressed genes 個(gè)

2.5 魯氏酵母菌GO富集分析結(jié)果

GO富集分析涵蓋了3個(gè)方面，分別描述基因的分子功能(molecular functions, MF)、細(xì)胞組分(cellular components, CC)、生物過程(biological processes, BP)，因此GO功能顯著性富集分析能給出差異表達(dá)基因與哪些生物學(xué)功能顯著相關(guān)。本研究通過對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，得到了發(fā)酵3、5、7 d的差異基因GO富集柱狀圖(圖3)。在圖3中，縱坐標(biāo)為富集的GO term，橫坐標(biāo)為該term中差異基因的數(shù)量，本研究挑選了富集最顯著的30個(gè)GO term。

與對(duì)照組比較，在發(fā)酵3 d時(shí)，在YPD+Fru組中，魯氏酵母菌MF組中涉及催化還原、氧化還原酶的差異基因比較多。催化還原中有1 401個(gè)上調(diào)基因，1 249個(gè)下調(diào)基因；氧化還原酶活性有306個(gè)上調(diào)基因和233個(gè)下調(diào)基因。在CC組中，涉及膜蛋白復(fù)合物和線粒體的差異基因比較多。膜蛋白復(fù)合物有129個(gè)上調(diào)基因和107個(gè)下調(diào)基因；線粒體有83個(gè)上調(diào)基因和63個(gè)下調(diào)基因。在BP組中，涉及單個(gè)有機(jī)體代謝過程的差異表達(dá)基因最多，有718個(gè)基因上調(diào)表達(dá)和578個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。在發(fā)酵5 d時(shí)，MF中涉及核糖體結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)分子活性的差異基因比較多。核糖體結(jié)構(gòu)中有22個(gè)上調(diào)基因和123個(gè)下調(diào)基因，細(xì)胞分子活性包括43個(gè)上調(diào)基因和163個(gè)下調(diào)基因。CC組中涉及細(xì)胞和細(xì)胞組分的差異基因比較多，細(xì)胞有470個(gè)上調(diào)基因和623個(gè)下調(diào)基因，細(xì)胞組分有470個(gè)上調(diào)基因和623個(gè)下調(diào)基因。BP組中涉及生物合成過程的差異表達(dá)基因最多，有402個(gè)上調(diào)基因和580個(gè)下調(diào)基因。在第7天時(shí)，MF組中涉及氧化還原酶活性、二價(jià)無機(jī)陽(yáng)離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性的差異基因比較多，氧化還原酶活性有51個(gè)上調(diào)基因和85個(gè)下調(diào)基因，二價(jià)無機(jī)陽(yáng)離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性有50個(gè)上調(diào)基因和40個(gè)下調(diào)基因。CC組中涉及轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物和ATP酶復(fù)合物的差異基因比較多，轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物有45個(gè)上調(diào)基因和31個(gè)下調(diào)基因，ATP酶復(fù)合物包含32個(gè)上調(diào)基因和43個(gè)下調(diào)基因。BP組中涉及差異表達(dá)基因最多的是DNA模板，轉(zhuǎn)錄起始，有62個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，54個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到3 d時(shí)，分子功能方面涉及到的基因變化是最明顯的，發(fā)酵進(jìn)行到5 d時(shí)，與細(xì)胞組分相關(guān)的基因變化最明顯，發(fā)酵進(jìn)行到7 d時(shí)，受底物濃度和魯氏酵母自身代謝的影響，差異基因數(shù)目減少，與生物過程相關(guān)的基因變化最明顯。

圖3 差異基因GO富集柱狀圖Fig.3 GO enrichment histograms of differentially expressed genes

2.6 KEGG pathway富集分析

KEGG是系統(tǒng)分析基因功能和基因組信息的數(shù)據(jù)庫(kù)。通過KEGG pathway富集能確定差異表達(dá)基因參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。KEGG pathway分析結(jié)果如表3顯示，發(fā)酵第3天和7天時(shí)富集到兩個(gè)相同的代謝通路：生物素代謝和氨酰基-tRNA的生物合成；發(fā)酵第5天時(shí)則富集到較多的代謝通路。選取了排名靠前的顯著性富集通路進(jìn)行分析，這些通路主要涉及的差異基因包括：次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成、丙酮酸代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝以及果糖甘露糖代謝。魯氏酵母菌代謝過程中能夠合成很多的風(fēng)味物質(zhì)，如呋喃酮和甲酸乙酯等都屬于其次級(jí)代謝產(chǎn)物，糖類物質(zhì)與氨基酸代謝也有助于魯氏酵母菌風(fēng)味化合物的合成。

3 結(jié) 論

隨著對(duì)魯氏酵母菌耐高糖和耐鹽機(jī)理研究的深入，其在改善豆醬和醬油等發(fā)酵食品風(fēng)味的功能也不斷被挖掘，添加糖類物質(zhì)對(duì)魯氏酵母的影響也逐漸被人們所關(guān)注。本研究結(jié)果表明，添加D-果糖會(huì)影響魯氏酵母菌的生理特性，促進(jìn)魯氏酵母菌OD值和細(xì)胞菌數(shù)增加，產(chǎn)生的酸類物質(zhì)增多，降低發(fā)酵體系的pH值。在發(fā)酵后期，D-果糖促進(jìn)魯氏酵母菌代謝合成較多的醇類、酯類和酮類等風(fēng)味物質(zhì)，為其在發(fā)酵食品中增香提供了理論依據(jù)。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果表明，與對(duì)照組相比較，D-果糖調(diào)控使魯氏酵母菌的差異基因數(shù)增加，功能差異基因、細(xì)胞組分差異基因和生物過程差異基因隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行其差異基因數(shù)變化較大；同時(shí)KEGG pathway結(jié)果表明，這些差異基因涉及果糖代謝、次級(jí)代謝和氨基酸代謝等多種與魯氏酵母代謝密切相關(guān)的途徑?？山Y(jié)合風(fēng)味物的變化與相應(yīng)的基因變化驗(yàn)證挖掘關(guān)鍵基因，并可進(jìn)一步構(gòu)建魯氏酵母工程菌。本研究初步探索了外源D-果糖調(diào)控魯氏酵母菌增香的分子機(jī)制，明確了D-果糖調(diào)控后魯氏酵母菌生理特性的變化，希望為進(jìn)一步提高魯氏酵母菌增香及其在發(fā)酵食品中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

表3 差異基因KEGG pathway富集結(jié)果Tab.3 KEGG pathway of differentially expressed genes