使細(xì)胞治療成為攻克疾病的新一代技術(shù)手段——陳志國(guó)教授

李 默 韓德強(qiáng) 趙 宇 陳志國(guó)

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院細(xì)胞治療中心, 北京 100053)

1 個(gè)人簡(jiǎn)介

陳志國(guó)教授(圖1)，1977年11月出生于江蘇省邳州市，首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院細(xì)胞治療中心主任，萬(wàn)人計(jì)劃科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才。2012年獲北京市海外高層次人才稱號(hào)、北京市特聘專家，2015年獲北京市科學(xué)技術(shù)一等獎(jiǎng)(排名九)，2016年獲牛頓高級(jí)學(xué)者獎(jiǎng)，2018年獲“科學(xué)中國(guó)人年度人物”。1999年畢業(yè)于南開(kāi)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，后赴瑞典卡羅琳斯卡醫(yī)學(xué)院攻讀博士學(xué)位，研究領(lǐng)域?yàn)樯窠?jīng)科學(xué)和免疫學(xué)。2004-2010年在斯坦福大學(xué)干細(xì)胞研究所進(jìn)行博士后深造，致力于神經(jīng)干細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制以及胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用。2010年3月歸國(guó)在首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院細(xì)胞治療中心任職，2014年被聘為首都醫(yī)科大學(xué)教授。就職期間主要在干細(xì)胞治療神經(jīng)退行性疾病的基礎(chǔ)與臨床轉(zhuǎn)化研究以及抗腫瘤免疫治療新技術(shù)研究方面取得了突出成績(jī)。在細(xì)胞轉(zhuǎn)分化治療帕金森病的研究中，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的跨胚層轉(zhuǎn)化，可將人的皮膚細(xì)胞、外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)為人誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞(human induced neural stem cell，hiNSCs)，為自體移植治療帕金森病的臨床應(yīng)用開(kāi)辟了新的途徑。在抗腫瘤免疫治療方面，2018年自主研發(fā)了具有選擇性擴(kuò)增活性的CD19特異性人源化CAR受體(CD19 hsCAR)，CD19hsCAR修飾性T細(xì)胞對(duì)鼠源CD19CAR-T治療緩解后復(fù)發(fā)以及對(duì)鼠源性CD19CAR-T原發(fā)抵抗的急性B淋巴細(xì)胞白血病(B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL)患者具有良好的臨床療效，為腫瘤患者帶來(lái)福音。

圖1 陳志國(guó)教授

陳志國(guó)教授先后主持國(guó)家“973”計(jì)劃項(xiàng)目1項(xiàng)，國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃干細(xì)胞與轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)項(xiàng)目1項(xiàng)，國(guó)家自然科學(xué)基金7項(xiàng)(其中國(guó)家優(yōu)秀青年科學(xué)基金1項(xiàng)、國(guó)際合作項(xiàng)目2項(xiàng))，北京市自然科學(xué)基金1項(xiàng)，“長(zhǎng)城學(xué)者”、“拔尖團(tuán)隊(duì)” 等北京市屬人才項(xiàng)目；發(fā)表SCI論文57篇，相關(guān)研究成果發(fā)表在包括ClinicalCancerResearch、CellResearch、Theranostics、BrainBehaviorandImmunity、CellDeathandDisease、CellDiscovery等行業(yè)高水平期刊上(圖2)。

圖2 北京市科學(xué)技術(shù)獎(jiǎng)獲獎(jiǎng)證書

2 主要學(xué)術(shù)貢獻(xiàn)

2.1 帕金森病細(xì)胞治療基礎(chǔ)和臨床轉(zhuǎn)化研究

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是最常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一，國(guó)際流行病學(xué)調(diào)查顯示,2005年中國(guó)大約有200萬(wàn)PD患者，預(yù)計(jì)到2030年中國(guó)的PD患者將接近500萬(wàn)，而全球的PD患者將超過(guò)870萬(wàn)。目前臨床上沒(méi)有能夠徹底治愈帕金森病的方法，主要通過(guò)藥物和手術(shù)緩解癥狀。癥狀初期通常采用多巴胺受體激動(dòng)劑、單胺氧化酶抑制劑，隨著患者癥狀加重給予左旋多巴對(duì)癥治療，疾病終末期藥物無(wú)法控制癥狀時(shí)部分患者采用腦深層刺激術(shù)(deep brain stimulation, DBS)改善癥狀。大多數(shù)的帕金森病患者最終會(huì)出現(xiàn)自律神經(jīng)疾患、睡眠障礙、認(rèn)知功能減退等問(wèn)題，這些癥狀(尤其是認(rèn)知功能減退)是造成患者殘障的主因。無(wú)論是藥物治療還是手術(shù)治療，現(xiàn)有的治療方式都無(wú)法從根本上治愈帕金森病，也無(wú)法阻止病情的進(jìn)展。

PD的主要病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)致密部多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元發(fā)生退行性病變和丟失。補(bǔ)充缺失的多巴胺神經(jīng)元的細(xì)胞治療方法有望成為治療帕金森病有效途徑。20世紀(jì)80～90年代，歐洲和美國(guó)進(jìn)行了一系列針對(duì)PD細(xì)胞移植治療的臨床研究，通過(guò)移植流產(chǎn)胎兒中腦腹側(cè)的神經(jīng)前體細(xì)胞到患者的紋狀體，部分患者的運(yùn)動(dòng)功能可以得到長(zhǎng)期恢復(fù)，移植的DA神經(jīng)前體細(xì)胞在成年腦內(nèi)可以分化成DA神經(jīng)元，并釋放DA。這些臨床研究證明了細(xì)胞治療在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的巨大潛能。然而這些臨床試驗(yàn)由于并未達(dá)到預(yù)期的終點(diǎn)試驗(yàn)要求而告終。早期臨床研究失敗的可能原因：一是流產(chǎn)胎兒腦組織來(lái)源有限且存在倫理學(xué)問(wèn)題；另外對(duì)于PD患者來(lái)說(shuō)這些移植的細(xì)胞為同種異體細(xì)胞，會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)；最后，植入組織具有異質(zhì)性，不僅含有DA神經(jīng)細(xì)胞，也包含如5-羥色胺(serotonin，5-HT)神經(jīng)細(xì)胞等其他類型的細(xì)胞。移植到腦內(nèi)后，非DA細(xì)胞整合到神經(jīng)環(huán)路中會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)。

將體細(xì)胞直接重編程為具有多能性的誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(pluripotent stem cells，PSCs)技術(shù)的問(wèn)世，使得使用患者自體來(lái)源的細(xì)胞治療PD成為可能，有可能解決流產(chǎn)胎兒組織所伴隨的一些問(wèn)題。然而，iPSCs制備和分化周期長(zhǎng)，并存在一定程度潛在的致瘤性，這些因素限制了其在臨床上的應(yīng)用。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)作為神經(jīng)系統(tǒng)的成體干細(xì)胞，在PD治療中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。然而，其來(lái)源的局限性和異基因移植可能引發(fā)免疫排斥反應(yīng)限制了其在臨床上的應(yīng)用。陳志國(guó)教授團(tuán)隊(duì)及合作者借鑒了iPSCs的思路，創(chuàng)造性地完成了將體細(xì)胞不經(jīng)iPSCs階段直接重編程為iNSCs的成果。這項(xiàng)成果的意義在于為干細(xì)胞移植治療PD拓展了新的細(xì)胞來(lái)源，使患者有可能利用自體來(lái)源且安全性高的細(xì)胞移植治療帕金森病[1-2]。

之后，陳志國(guó)教授團(tuán)隊(duì)用非整合質(zhì)粒載體將健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)誘導(dǎo)成為神經(jīng)干細(xì)胞，此類細(xì)胞擁有神經(jīng)干細(xì)胞特性，能分化成神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元及少突膠質(zhì)細(xì)胞等。在進(jìn)一步的研究中，陳志國(guó)教授團(tuán)隊(duì)利用仙臺(tái)病毒載體攜帶外源基因?qū)⒊扇送庵苎獑蝹€(gè)核細(xì)胞重編程為神經(jīng)干細(xì)胞；鑒定了重編程得到的誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞的安全性，包括外源基因的沉默，仙臺(tái)病毒載體的滅活，全基因組測(cè)序是否存在有害突變；在體外將誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化為DA神經(jīng)元并確定細(xì)胞體內(nèi)移植的最佳時(shí)間點(diǎn)；將誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化獲得的DA神經(jīng)前體細(xì)胞移植入免疫缺陷PD小鼠紋狀體內(nèi)，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了該細(xì)胞的安全性及有效性。成人外周血同皮膚成纖維細(xì)胞相比，取材更加簡(jiǎn)單、安全，患者接受的程度更高。這項(xiàng)成果具有巨大的臨床應(yīng)用前景和社會(huì)效益，目前已經(jīng)獲批專利[3-4]。

2.2 異基因神經(jīng)干細(xì)胞移植引發(fā)宿主免疫識(shí)別的機(jī)制研究

目前干細(xì)胞移植治療PD研究中使用的細(xì)胞來(lái)源大部分為同種異體細(xì)胞(異基因移植物)。然而，移植異基因的干細(xì)胞有可能會(huì)引起宿主體內(nèi)的免疫反應(yīng)，從而影響移植效果。因此，深入研究異基因移植物引發(fā)的免疫反應(yīng)的機(jī)制對(duì)干細(xì)胞移植治療PD今后的應(yīng)用具有重要意義[5]。

圖3 誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞制備技術(shù)路線

此外，陳志國(guó)教授團(tuán)隊(duì)和合作者成功將小鼠成纖維細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為具有功能的多巴胺能神經(jīng)元(induced dopaminergic neuron，iDA)。通過(guò)使用不同的外源因子組合，可以獲得表達(dá)多巴胺能神經(jīng)元特異性標(biāo)志物并具有電生理功能的iDA。這項(xiàng)成果為干細(xì)胞移植治療帕金森病拓展了新的細(xì)胞來(lái)源，同時(shí)填補(bǔ)了跨胚層直接轉(zhuǎn)分化的理論空白[2]。

2.3 干細(xì)胞移植治療帕金森病在小動(dòng)物和大動(dòng)物模型上的應(yīng)用

干細(xì)胞移植治療帕金森病在開(kāi)展臨床試驗(yàn)前，必須在動(dòng)物模型上完成安全性和有效性的驗(yàn)證。陳志國(guó)教授團(tuán)隊(duì)在此方向一直居于全國(guó)乃至世界的前列，取得了重要成果。陳志國(guó)教授團(tuán)隊(duì)成功完成了自體iPSCs獲得的多巴胺能神經(jīng)元移植治療非人靈長(zhǎng)類PD模型的工作。非人靈長(zhǎng)類因其與人類的高度相似性，是干細(xì)胞治療的臨床前大動(dòng)物在體研究極為理想的載體。該團(tuán)隊(duì)成功獲得了成年食蟹猴的iPSCs，并將其分化為多巴胺能神經(jīng)前體細(xì)胞。在將該食蟹猴制成帕金森病模型后，移植了自體多巴胺能神經(jīng)前體細(xì)胞。經(jīng)過(guò)6個(gè)月的觀察，PD模型食蟹猴的行為學(xué)癥狀明顯改善，且沒(méi)有任何不良反應(yīng)，安全性好,有大量細(xì)胞存活并分化為多巴胺能神經(jīng)元。這項(xiàng)成果在理論上證明了自體來(lái)源iPSCs獲得的神經(jīng)前體細(xì)胞治療PD的安全性和有效性，為今后利用自體iPSCs移植治療PD的臨床應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[6]。

陳志國(guó)教授團(tuán)隊(duì)還成功證明了表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)對(duì)非人靈長(zhǎng)類PD模型的保護(hù)作用。這項(xiàng)成果為利用GDNF治療帕金森病提供了新的方法，也為利用自體BMMSCs治療帕金森病的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)[7]。

2.4 具有體外定向擴(kuò)增功能的人源化嵌合抗原受體修飾性T細(xì)胞(CD19 hsCAR-T)治療技術(shù)

作為抗腫瘤免疫治療領(lǐng)域的突破性細(xì)胞制劑，嵌合抗原受體修飾性T細(xì)胞在治療血液性腫瘤方面取得了令人矚目的成果，并成為應(yīng)用于血液系統(tǒng)腫瘤治療的又一種創(chuàng)新性生物制劑。然而，CAR-T在臨床應(yīng)用依然面臨的諸多瓶頸。緩解后復(fù)發(fā)和原發(fā)性抵抗是其中兩個(gè)尤為突出的問(wèn)題。最新研究結(jié)果表明，接受了鼠源性CAR-T治療后緩解的患者中，大約50%1年內(nèi)復(fù)發(fā)；另外還有20%左右的人群在首次接受CAR-T治療時(shí)沒(méi)有響應(yīng)[8-9]。而目前針對(duì)鼠源性CAR-T治療后CD19陽(yáng)性復(fù)發(fā)的患者再次輸注CAR-T進(jìn)行治療的有效率性極低；進(jìn)而限制了CAR-T在臨床的進(jìn)一步推廣。

為解決上述難題，陳志國(guó)教授帶領(lǐng)研究團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新性的研發(fā)了一款具有選擇性擴(kuò)增活性的CD19特異性恰合抗原受體分子，CD19hsCAR(圖4)。該分子將鼠源性CD19特異性嵌合抗原受體的抗原特異性識(shí)別結(jié)構(gòu)域進(jìn)行人源化改造，同時(shí)嵌入選擇性結(jié)構(gòu)域，在提高嵌合抗原受體對(duì)CD19靶點(diǎn)親和力的同時(shí)，利用選擇性結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)修飾性T細(xì)胞的體外定向擴(kuò)增；一方面提高了CD19CAR-T對(duì)靶細(xì)胞的殺傷能力；另一方面通過(guò)體外二次選擇性活化，提高了CD19CAR-T終產(chǎn)品的純度，增強(qiáng)其記憶性細(xì)胞亞群的比例，延長(zhǎng)其在體內(nèi)的持久性(圖5)。此外，通過(guò)人源化改造，降低了鼠源性CD19CAR的免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)，提高了其臨床應(yīng)用的安全性，解決了鼠源性CD19CAR-T輸注后復(fù)發(fā)且多次輸注無(wú)效的技術(shù)瓶頸，提高了CD19CAR-T臨床應(yīng)用的適用性[10]。

圖4 CD19hsCAR結(jié)構(gòu)示意圖

圖5 CD19hsCAR-T體內(nèi)抗腫瘤活性研究

目前，該項(xiàng)目已經(jīng)完成了Ⅰ期臨床研究(注冊(cè)號(hào)：ChiCTR 1800017439、ChiCTR1800014761)，同時(shí)與首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院開(kāi)展了Ⅱ期臨床研究(注冊(cè)號(hào)：NCT03902197)。臨床研究表明，CD19hsCAR-T對(duì)于鼠源性CD19CAR-T治療后復(fù)發(fā)或無(wú)效的患者的有效率為80%，且臨床安全性良好，該階段性成果發(fā)表在ClinicalCancerResearch雜志上(5年IF=9.5)。同時(shí)該技術(shù)也申請(qǐng)了多項(xiàng)國(guó)內(nèi)和國(guó)際專利，其中國(guó)內(nèi)發(fā)明專利的已授權(quán)2項(xiàng)(國(guó)內(nèi)專利授權(quán)號(hào)：ZL2018100685628，ZL201910510234.3)，并正在進(jìn)行成果轉(zhuǎn)化工作的推進(jìn)。

2.5 以iNSC為藥物遞送載體的新型抗腫瘤細(xì)胞制劑的研發(fā)

基于在干細(xì)胞領(lǐng)域取得的多項(xiàng)突破的基礎(chǔ)上，陳志國(guó)教授還創(chuàng)新性地利用誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞針對(duì)腫瘤組織的特異性歸巢能力，正在研發(fā)一款攜帶抗腫瘤效應(yīng)分子的iNSC特異性抗腫瘤細(xì)胞制劑。該制劑利用以健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞為種子細(xì)胞制備的iNSC為效應(yīng)細(xì)胞，通過(guò)基因修飾的手段讓其共表達(dá)TNF-α和TK兩種抗腫瘤活性分子，開(kāi)展針對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的臨床前研究及療效評(píng)估工作。該項(xiàng)工作獲得了國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目的資助，相關(guān)研究工作正在進(jìn)行中。