圈養(yǎng)野生動(dòng)物糞便中大腸桿菌的分離鑒定和耐藥性分析

劉 青 雷 蕾 李 偉 仉 偉 林德貴* 汪 洋* 謝緒昌*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京，100193；2.濟(jì)南動(dòng)物園，濟(jì)南，250031)

目前動(dòng)物細(xì)菌感染性疾病防治主要依賴抗菌藥物[1]，抗菌藥長(zhǎng)期不當(dāng)使用導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性問題變得日益嚴(yán)峻，全國(guó)各地均出現(xiàn)了不同程度的耐藥菌，而且交叉耐藥、多重耐藥現(xiàn)象也在加劇[2]。大腸桿菌(Escherichiacoli)為革蘭氏陰性菌，在土壤、水、動(dòng)物糞便等多種環(huán)境中均有分離，是人和動(dòng)物消化道的常見菌，也是進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查和研究的重要指示菌。大腸桿菌不僅可以通過外源捕獲耐藥基因和自身基因突變產(chǎn)生耐藥性，還可將耐藥因子進(jìn)行垂直和水平傳播，可以通過食物鏈或接觸等方式在不同的生態(tài)系統(tǒng)間傳播[3-4]，成為動(dòng)物體內(nèi)潛在的耐藥基因庫[5-6]。

圈養(yǎng)野生動(dòng)物抗菌藥物主要用于個(gè)體動(dòng)物抗感染治療，部分用于細(xì)菌性疾病的預(yù)防，沒有作為促生長(zhǎng)劑添加使用，但在臨床治療過程中多重耐藥菌的比例也日益增多。據(jù)報(bào)道圈養(yǎng)虎(Pantheratigris)源大腸桿菌對(duì)氯霉素的耐藥率達(dá)85%，對(duì)氟苯尼考的耐藥率為78%[7]；陸曉健等[8]從某動(dòng)物園中分離出69株大腸桿菌進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，結(jié)果對(duì)頭孢唑林、四環(huán)素、復(fù)方新諾明的耐藥率分別達(dá)41.42%、61.13%、48.28%；伍清林等[9]從圈養(yǎng)珍禽舍及動(dòng)物體內(nèi)分離的18株大腸桿菌均為多重耐藥菌株。圈養(yǎng)野生動(dòng)物耐藥菌的不斷增加，給臨床治療帶來不小的壓力，因此通過對(duì)動(dòng)物體內(nèi)常在菌抗菌藥物耐藥性的檢測(cè)，了解動(dòng)物群體耐藥性，探索耐藥性產(chǎn)生的原因至關(guān)重要，不僅為臨床治療合理用藥提供參考和指導(dǎo)，也為制定野生動(dòng)物抗菌藥物應(yīng)用政策、管理措施及評(píng)價(jià)干預(yù)手段等提供數(shù)據(jù)。圈養(yǎng)野生動(dòng)物有種類多、數(shù)量少的特點(diǎn)，本文按照食性結(jié)構(gòu)將其分為四大類：草食動(dòng)物、雜食動(dòng)物、肉食動(dòng)物及禽類動(dòng)物進(jìn)行耐藥性分析。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2019年5—10月，用無菌棉簽采集圈養(yǎng)野生動(dòng)物新鮮糞便，放入含有500 μL無菌PBS的1.5 mL離心管中，其中包括草食動(dòng)物40份，雜食動(dòng)物27份，禽類26份，肉食類14份，合計(jì)采集樣本107份；采集動(dòng)物常用蔬菜5份、水果3份、肉類3份、魚類5份、顆粒料2份、飲水2份，共計(jì)20份至無菌密封袋內(nèi)，冰盒暫存，2 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。

1.2 試劑與材料

抗生素標(biāo)準(zhǔn)品：β-內(nèi)酰胺類(氨芐青霉素、阿莫西林、頭孢唑啉、頭孢噻肟鈉、美羅培南)、多肽類(多黏菌素)、喹諾酮類(諾氟沙星、環(huán)丙沙星)、氨基糖苷類(卡那霉素、慶大霉素)、酰胺醇類(氯霉素、氟苯尼考)、四環(huán)素類(土霉素、多西環(huán)素)、磺胺類(磺胺甲噁唑)購自北京索萊寶科技有限公司；麥康凱瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、腦心浸液肉湯、MH肉湯培養(yǎng)、緩沖蛋白胨水(BPW)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；ECC顯色培養(yǎng)基購自上海欣中生物工程有限公司；質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC 25922購自山東鑫科生物科技股份有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 抗生素的配制

按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI 2017)中的方法配制抗生素儲(chǔ)存液，-20 ℃保存待用。

2.2 大腸桿菌的分離

將500 μL含有糞樣的PBS加入內(nèi)含2 mL滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h；將食物樣品25 g加入225 mL BPW中充分振蕩，將洗滌液置于搖床中復(fù)活4 h后，取500 μL加入含2 mL滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h。將擴(kuò)增后的菌液稀釋到適宜濃度涂布到ECC顯色培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18—24 h，選取平板上藍(lán)綠色單菌落進(jìn)行純化，純化后挑取單菌落至1 mL腦心浸液肉湯中培養(yǎng)4 h，取400 μL菌液加入200 μL 60%甘油中，-20 ℃冷凍保存。

2.3 大腸桿菌的鑒定

采用水煮法提取純化后的細(xì)菌DNA，利用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物(16S-F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，16S-R：GGTTACCTTGTTACGACTT)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，陽性產(chǎn)物送至上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與GenBank中參考菌株的序列進(jìn)行相似性比對(duì)，同源性達(dá)到99%以上即判定為大腸桿菌。

2.4 耐藥性檢測(cè)

根據(jù)CLSI推薦的微量肉湯法，對(duì)分離的大腸桿菌進(jìn)行抗菌藥物最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)檢測(cè)，陽性對(duì)照為大腸桿菌ATCC 25922菌株，結(jié)果判定參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)以敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)3種形式記錄。

2.5 耐藥基因型檢測(cè)

引物序列及反應(yīng)條件見表1，PCR體系：2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O補(bǔ)齊至25 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性0.5 min，退火0.5 min溫度見表1，延伸時(shí)間見表1，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。1%—2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)觀察。

續(xù)表1

3 結(jié)果與分析

3.1 大腸桿菌分離鑒定

動(dòng)物糞便樣本中大腸桿菌的分離率為100%，食物源大腸桿菌的分離率65%，共計(jì)分離出120株。其中草食動(dòng)物40株，雜食動(dòng)物27株，肉食動(dòng)物14株，禽類動(dòng)物26株，食物13株，具體分離情況見表2。

3.2 體外藥物耐藥率結(jié)果

通過對(duì)分離出的120株大腸桿菌耐藥性進(jìn)行檢測(cè)，動(dòng)物源大腸桿菌有49.5%菌株對(duì)至少1種抗生素耐藥，其中四環(huán)素和磺胺類耐藥率最高，均為41.1%，其次是β-內(nèi)酰胺類、酰胺醇類和氨基糖苷類，分別為31.8%、17.8%、14.0%，多肽類和喹諾酮類較敏感，分別為3.7%和4.7%，沒有出現(xiàn)耐美羅培南菌株，15種抗菌藥物耐藥率見圖1。

不同種動(dòng)物對(duì)抗菌藥物的耐藥情況有顯著差異，其中肉食動(dòng)物源大腸桿菌中92.9%的菌株對(duì)至少1種藥物耐藥，其次是禽類動(dòng)物源和雜食動(dòng)物源大腸桿菌，分別是69.2%、48.1%，草食動(dòng)物較低為22.5%，食物樣本中僅分離出1株耐藥菌，詳細(xì)結(jié)果見表3。

對(duì)3類及以上抗菌藥物耐藥定義為多重耐藥菌，共計(jì)分離出35株多重耐藥菌，其中從肉食動(dòng)物、禽類動(dòng)物中分離的多重耐藥菌株較多，均為12株，其次為雜食動(dòng)物，草食動(dòng)物最低，僅1株。

表2 大腸桿菌分離統(tǒng)計(jì)

圖1 圈養(yǎng)野生動(dòng)物糞便大腸桿菌對(duì)15種抗菌藥物的耐藥率結(jié)果Fig.1 Results of resistance rate of fecal Escherichia coli of wild animals to 15 antimicrobial agents

表3 大腸桿菌耐藥表型結(jié)果

圖2 不同種類圈養(yǎng)野生動(dòng)物糞便大腸桿菌多重耐藥情況對(duì)比Fig.2 Comparison of multiple drug resistance of fecal Escherichia coli in different kinds of wild animals

3.3 耐藥基因型檢測(cè)結(jié)果

對(duì)53株動(dòng)物源性耐藥菌和1株食物源性耐藥菌進(jìn)行22種耐藥基因型檢測(cè)，結(jié)果顯示tetA、sulII、blaTEM是最流行的耐藥基因。動(dòng)物源性耐藥菌有50% β-內(nèi)酰胺類耐藥菌株攜帶blaTEM基因，四環(huán)素類耐藥菌株有78.2%攜帶tetA基因，磺胺類耐藥菌株有45.5%攜帶sulII基因。耐酰胺醇類、四環(huán)素和磺胺類菌株可檢測(cè)出攜帶兩種以上耐藥基因(表4)。

表4 耐藥基因型檢測(cè)結(jié)果

4 討論

本研究初步調(diào)查了該園區(qū)圈養(yǎng)野生動(dòng)物糞便中大腸桿菌的耐藥情況，107株動(dòng)物源性樣本中，49.5%的菌對(duì)至少1種抗菌藥物耐藥。對(duì)磺胺類、四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類的耐藥率較高，分別為41.1%、41.1%、31.8%，這一結(jié)果普遍低于畜牧業(yè)中豬源、禽源大腸桿菌的耐藥率[10-12]。圈養(yǎng)野生動(dòng)物大腸桿菌耐藥性的產(chǎn)生與多種因素有關(guān)。

4.1 抗菌藥物使用

本研究中四環(huán)素和磺胺類抗生素耐藥率較高，這與陸曉健等[8]的檢測(cè)結(jié)果一致。野生動(dòng)物在治療時(shí)為降低應(yīng)激反應(yīng)，在動(dòng)物可以自主采食的前提下首選口服藥物進(jìn)行治療，磺胺類藥物中的復(fù)方新諾明又是常用的口服用藥之一，使用時(shí)間長(zhǎng)、范圍廣，這可能是其產(chǎn)生高耐藥率的重要因素。此外磺胺類藥物主要耐藥基因sul可通過轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒和整合子在細(xì)菌間傳遞[13]，進(jìn)一步提高了細(xì)菌對(duì)該類藥物的抗性。其中sulII、sulI檢出率較高，與部分豬源、禽源、狐源等大腸桿菌耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果相同[14-18]。

β-內(nèi)酰胺類藥物也是臨床中使用較多的一類抗生素，其中第一代頭孢菌素使用時(shí)間較長(zhǎng)，所檢測(cè)出的耐藥菌株對(duì)青霉素和阿莫西林、頭孢唑啉耐藥濃度均大于128 μg/mL，顯示出了較高的耐藥性。近幾年隨著第三代頭孢菌素在野生動(dòng)物治療領(lǐng)域的普及使用，約1/3菌株對(duì)頭孢噻肟耐藥，韓天飛等[19]指出TEM型β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因總體呈現(xiàn)檢出率高、亞型多的特點(diǎn)，本研究中有50%耐藥菌株攜帶blaTEM基因，因此要特別注意超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生。

喹諾酮類耐藥率較低，為4.7%，僅在肉食動(dòng)物和雜食動(dòng)物糞便中分離出4株和1株耐喹諾酮類耐藥菌株，這與臨床用藥相一致。另外多肽類藥物在該園區(qū)沒有用藥記錄，耐藥基因的來源有待進(jìn)一步研究。

4.2 耐藥基因傳播方式

牛建寧等[20]指出大腸桿菌對(duì)四環(huán)素的耐藥性是所有抗生素中最嚴(yán)重的，這與四環(huán)素廣泛被用于治療、預(yù)防以及用作生長(zhǎng)促進(jìn)劑緊密相關(guān)。園區(qū)內(nèi)四環(huán)素類藥物中常用的是土霉素，主要用于腸道感染的治療，但近幾年的使用量明顯減小，也沒有作為促生長(zhǎng)劑添加使用，高耐藥的產(chǎn)生可能與該類藥物耐藥基因的傳播方式有關(guān)。tet基因廣泛存在于人、動(dòng)物和環(huán)境中分離的細(xì)菌中，大多數(shù)tet基因都與結(jié)合或移動(dòng)元素相連，在細(xì)菌的種間或?qū)匍g進(jìn)行轉(zhuǎn)移，因此在細(xì)菌中廣泛分布。本研究中有78.2%的耐藥菌株攜帶tetA基因，提示主動(dòng)外排作用是對(duì)四環(huán)素類藥物產(chǎn)生耐藥性的主要機(jī)制。

氨基糖苷類抗生素對(duì)多數(shù)革蘭氏陰性菌桿菌有較強(qiáng)的作用，常用于消化道疾病的治療，常用的是慶大霉素、卡那霉素。這2種藥物在臨床治療中使用較普遍，但耐藥率較低，本研究中檢測(cè)到的耐藥基因全部來源于氨基糖苷修飾酶的化學(xué)修飾作用，沒有檢測(cè)到位于可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的復(fù)合轉(zhuǎn)座子上的armA基因。

4.3 動(dòng)物種屬差異性

四大類動(dòng)物耐藥率差異明顯，草食動(dòng)物耐藥率最低，多重耐藥菌株也最少，雜食動(dòng)物、禽類動(dòng)物其次，肉食動(dòng)物耐藥率最高，多重耐藥也最嚴(yán)重，產(chǎn)生這一種屬差異的原因推測(cè)有二。第一，與用藥方式有關(guān)?？诜咕幬飼?huì)對(duì)草食動(dòng)物瘤胃內(nèi)微生物群落的發(fā)育、繁殖有強(qiáng)烈的抑制作用，可造成嚴(yán)重的消化機(jī)能障礙，因此草食動(dòng)物抗菌藥物的使用均為個(gè)體抗感染治療，也很少選用廣譜抗生素，群體抗菌藥物的使用量明顯低于其他種屬動(dòng)物。其二，推測(cè)與飲食結(jié)構(gòu)有關(guān)。草食動(dòng)物食物組成主要以牧草為主，還有少量果蔬和精飼料組成，在這些食物樣本檢測(cè)中均未分離出耐藥菌株。肉食動(dòng)物，包括以肉類為主食的禿鷲(Aegypiusmonachus)、兀鷲(Gypsfulvus)等猛禽，對(duì)7大類抗菌藥物都表現(xiàn)出較高的耐藥性，且與主要食物肉塊中分離出的耐藥菌株的耐藥表型和耐藥基因型相近。值得注意的是，對(duì)耐藥菌的基因型檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，酰胺醇類耐藥基因中介導(dǎo)氟苯尼考耐藥的floR基因檢出率達(dá)45.5%，但這類藥物并未用于肉食動(dòng)物的抗感染治療。

如何防范圈養(yǎng)野生動(dòng)物細(xì)菌耐藥性的進(jìn)一步發(fā)展值得深思，合理使用抗菌藥物是減少耐藥菌株的有效措施，臨床治療時(shí)不能經(jīng)驗(yàn)性選藥，要明確感染病原菌類型，有針對(duì)性地進(jìn)行治療，要重視藥物敏感性檢測(cè)，提升藥物使用效率。其次還要加強(qiáng)食物檢測(cè)力度，特別是容易攜帶耐藥菌的肉類產(chǎn)品，以減少耐藥基因的產(chǎn)生以及誘導(dǎo)產(chǎn)生的條件，從而改善圈養(yǎng)野生動(dòng)物細(xì)菌性耐藥現(xiàn)狀。