血清蛋白組學(xué)對高脂血癥性胰腺炎患者治療前后的差異性分析

邱嘉華 李俊達（通訊作者） 黃敏 陳一婧 葛安琪

（深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科 廣東 深圳 518109）

高脂血癥已成為急性胰腺炎的主要病因之一，且高脂血癥性胰腺炎（HLP）發(fā)病率隨著人們生活習慣和飲食結(jié)構(gòu)的改變呈現(xiàn)上升趨勢[1]。與其他病因相比，HLP 具有發(fā)病年齡較輕、易復(fù)發(fā)的特點。但臨床上對HLP 的相關(guān)發(fā)病機制及診治認識不足，確切的發(fā)病機制尚不完全清楚。相對和絕對定量同位素標記（iTRAQ）是一種可以尋找差異表達蛋白和分析蛋白功能的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究中[2]。本文旨在采用iTRAQ 與二維液相色譜質(zhì)譜（2DLC-MS/MS）聯(lián)用技術(shù)對HLP 患者治療前后進行血清差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究，為尋找HLP 新的治療途徑開辟新思路。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年6 月—2019 年5 月我院收治的高脂血癥性急性胰腺炎患者30 例，所有入選患者符合診斷標準：中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會胰腺疾病學(xué)組修定的《中國急性胰腺炎診治指南（2019年，沈陽）》[3]，同時血甘油三酯（TG）≥11.30mmoL/L，或TG 5.65～11.3mmol/L，且血清呈乳糜狀。排除標準：伴有心血管疾病、機械性腸梗阻、消化性潰瘍并穿孔、膽管梗阻患者、長期飲酒者和其它原因引起的急性胰腺炎等患者。所有入組者均知情，通過醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2 主要試劑及儀器

iTRAQ 試劑盒、胰酶（Promega）、三乙基碳酸氫銨緩沖液TEAB、TCEP、MMTS、蛋白濃度檢測試劑盒、真空干燥儀冷凍離心機、分光光度計、恒溫箱、液相色譜儀、質(zhì)譜儀Q Exactive、ProteinPilot 4.0 軟件等。

1.3 實驗方法

1.3.1樣本采集、分組 所有入組病例均于治療前（入院時）、治療后7 天分別抽取患者空腹靜脈血5ml，靜置1h，3000r/min離心10min 后取上清液，分裝入EP 管中，編號后貯存于-80℃超低溫冰箱待檢。共收集HLP 治療前組30 例，均分為3 組，分別為HLP 治療前1 組、HLP 治療前2 組、HLP 治療前3 組（每組10 例）；HLP 治療后組30 例，均分為3 組，分別為HLP 治療后1 組、HLP 治療后2 組、HLP 治療后3 組（每組10 例）。

1.3.2 蛋白質(zhì)提取、定量 首先使用去高豐度蛋白試劑盒去除血清樣本中的高豐度蛋白后，進行蛋白提取，并用 Bradford法測定蛋白濃度（根據(jù)試劑盒說明書進行操作）。

1.3.3 蛋白酶解、iTRAQ 標記 取200ug 蛋白用胰酶消化至肽段水平，從冰箱中取出iTRAQ 試劑盒，平衡到室溫，按照手冊對樣品進行iTRAQ 標記。將HLP 治療前1 組、HLP 治療前2組、HLP 治療前3 組分別標記為：iTRAQ 113、iTRAQ 115、iTRAQ 117；將HLP 治療后1 組、HLP 治療后2 組、HLP 治療后3 組分別標記為：iTRAQ 114、iTRAQ 116、iTRAQ 118。3 個HLP 治療前組和3 個HLP 治療后組之間進行3 組重復(fù)試驗，減少實驗誤差。混合標記后的樣品，真空冷凍離心干燥，抽干后的樣品冷凍保存待用。

1.3.4 高PH 液 相 分 級 流 動 相A：H2O（NH3in H2O PH=10）；流動相B：80%ACN （NH3in H2O PH=10）。梯度洗脫條件：0 ～5min，5%B；5 ～10min，5%～10%B；10 ～60min，10%～40%B；60 ～65min，40%～95%B；65 ～75min，保 持95%B；75min ～85min，95%-5%B。真空冷凍離心干燥，抽干后的樣品冷凍保存待用。

1.3.5 納升級反相色譜-質(zhì)譜分析（nano-RPLC） 將高PH反相分離得到組分后，每管樣本用流動相A（2%ACN+0.1%FA）復(fù)溶。渦旋震蕩，12000prm，4℃離心20min，吸取上清，采用夾心上樣，Loading Pump 流速3ul/min，上樣10min，分離流速0.3ul/min，分離時間為60min。樣本經(jīng)nano 高效液相色譜分離后轉(zhuǎn)移到質(zhì)譜儀Q Exactive 進行分析。一級質(zhì)譜分辨率70000，掃描范圍350 ～1800m/z；二級質(zhì)譜分辨率17500。

1.4 數(shù)據(jù)分析及生物信息學(xué)分析

采用ProteinPilot4.5 軟件進行搜庫鑒定及定量分析，設(shè)置蛋白鑒定置信度為95%，且至少有一個肽段和庫中的肽段95%以上相匹配，同時進行蛋白反庫檢索，設(shè)置假陽性率（FDR）＜1%。選取差異倍數(shù)≥1.2 為上調(diào)蛋白，差異倍數(shù)≤0.83 為下調(diào)蛋白，所得結(jié)果進入分析。通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫篩選相關(guān)蛋白并進行分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2.結(jié)果

2.1 一般情況

30 例入組HLP 住院患者，男性19 例，女性11 例，年齡26～61 歲；平均（40.9±10.7）歲；30 例入組患者入院時（治療前）進行BISAP 評分[4]，平均（1.53±1.04）分；治療7 天后進行第二次評分，平均（0.4±0.62）分，評分顯著降低（P ＜0.05），所有患者均病情明顯好轉(zhuǎn)后出院。

2.2 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

共鑒定出蛋白質(zhì)367 種，基于篩查和鑒定差異蛋白質(zhì)的條件：選取差異倍數(shù)≥1.2 為上調(diào)蛋白，差異倍數(shù)≤0.83 為下調(diào)蛋白，并且P ＜0.05，與HLP 治療前組比較，HLP 治療后組發(fā)現(xiàn)顯著差異蛋白共有91 個，其中上調(diào)78 個，下調(diào)13 個，見表1。

表1 高脂血癥性胰腺炎患者治療前后血清差異蛋白列表

3.討論

HLP 的嚴重程度和并發(fā)癥發(fā)生率更高，其發(fā)生發(fā)展是多種因素共同參與、共同作用的復(fù)雜的病理生理過程。研究HLP 的發(fā)病機制，對于提高HLP 的治療效果具有重要意義。蛋白質(zhì)是各種生物活動的執(zhí)行者，絕大部分疾病的病理狀態(tài)和治療效應(yīng)均可體現(xiàn)在蛋白質(zhì)水平上。通過對HLP治療前后血清蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，篩選和鑒定顯著差異蛋白質(zhì)，有望尋找出新的治療靶點，提高臨床療效。本實驗結(jié)果共篩選出顯著性差異的蛋白91 個，其中差異最為明顯的蛋白質(zhì)有：MASP2、CLUS 和SAA1。

甘露糖結(jié)合凝集素相關(guān)絲氨酸蛋白酶2（MASP2）是補體凝集素途徑關(guān)鍵酶，以酶原形式存在，是天然免疫系統(tǒng)中的重要組分，有激活補體、促進調(diào)理吞噬、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及促進凋亡等功能[5]。MASP2 血清濃度在不同疾病及同一疾病不同階段不盡相同，與感染性疾病以及自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPL 患者治療后血清MASP2 水平上調(diào)，推測與機體啟動補體系統(tǒng)、抵御感染有關(guān)。

聚集素（CLUS）是一種多功能的糖蛋白復(fù)合體，作為對損傷等應(yīng)激反應(yīng)的應(yīng)答而在多種組織中表達，是一種新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制因子。研究發(fā)現(xiàn)在急性胰腺炎時CLUS 具有抗腺泡細胞凋亡的作用，從而減輕胰酶、炎癥因子釋放所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，同時提高CLUS 的表達可能有利于促進胰腺細胞的再生和修復(fù)，阻止病情的進展[6,7]。這和本次發(fā)現(xiàn)的HLP 患者治療后血清CLUS上調(diào)的結(jié)果一致，將為開辟一條新的治療途徑提供線索。

血清淀粉樣蛋白A1(SAAl)是一種急性期反應(yīng)蛋白，參與了機體炎癥反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展。當炎癥、組織損傷等激發(fā)時，IL-1、IL-6 等促炎因子調(diào)控肝細胞分泌大量SAA1[8]。SAAl 還是一種載脂蛋白，可代替載脂蛋白Al 作為高密度脂蛋白膽固醇的主要載脂蛋白，尤其在急性炎癥反應(yīng)時，SAA1 在高密度脂蛋白膽固醇的轉(zhuǎn)運過程中起主要作用[9]。近年來，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)過表達SAA 蛋白的腫瘤患者預(yù)后不佳[10]。故發(fā)現(xiàn)HLP 患者治療后血清SAA1 下調(diào)，可能成為治療效果或預(yù)后隨訪的指標。

本文篩選出了一系列HLP 相關(guān)的血清差異蛋白，這些蛋白可能為研究提高HLP 治療效果提供線索，但需要進一步深入研究。