天麻素穴位注射對(duì)癲癇模型大鼠認(rèn)知功能影響及機(jī)制探討*

閆禹竹,肖 飛△,崔永會(huì),焦志勤

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.哈爾濱市南崗區(qū)革新社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，黑龍江 哈爾濱 150000； 3.哈爾濱理工大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150000)

癲癇是以腦神經(jīng)元過度放電導(dǎo)致的發(fā)作性中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙為特征的慢性腦部疾病。其中近一半的癲癇病人可伴有認(rèn)知功能特別是學(xué)習(xí)記憶功能障礙[1]。因此，近年來如何治療癲癇伴學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能障礙成為神經(jīng)科學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。本課題通過觀察天麻素穴位注射對(duì)戊四氮致癇模型大鼠行為學(xué)及腦組織海馬區(qū)COX-2 mRNA表達(dá)的變化，探討天麻素穴注的抗癇及神經(jīng)保護(hù)作用及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供120只健康Wistar雄性大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量250～325 g。采用隨機(jī)數(shù)字表法將尾部標(biāo)記編號(hào)的實(shí)驗(yàn)大鼠分為空白組、模型組、穴注組及西藥組，每組各30只。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

按等效劑量比例換算方法，穴注天麻素(昆明制藥集團(tuán)股份有限公司,批號(hào)：H20013046,規(guī)格：0.2 g/支)成人用量：0.088 6 mL/kg，換算后實(shí)驗(yàn)大鼠用量：0.37 mL/kg；丙戊酸鈉片(山東仁和堂有限公司，批號(hào)：H19983059，規(guī)格:0.2 g/片)放置于4 ℃環(huán)境下遮光保存；戊四氮(PTZ，美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)：Sigma-p6500)配制成戊四氮溶液(PTZ溶液，濃度：2 mg/mL)；10%水合氯醛溶液；Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；PCR擴(kuò)增儀(MJ Research公司)。

1.3 造模方法

除空白組外，每日上午8：30—11：30模型組、穴注組及西藥組大鼠腹腔注射PTZ溶液35 mg/kg，空白組給予等劑量生理鹽水腹腔注射，連續(xù)注射28 d以點(diǎn)燃戊四氮癲癇大鼠動(dòng)物模型。每次注射治療后，觀察模型大鼠的行為學(xué)變化1 h，并根據(jù)Racine分級(jí)[2]判斷評(píng)估及記錄大鼠癲癇發(fā)作的級(jí)別。對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠可能發(fā)生的意外情況進(jìn)行干預(yù)。在造模周期28 d內(nèi)連續(xù)5 d出現(xiàn)Ⅳ級(jí)及以上的癇性發(fā)作，視為戊四氮癲癇大鼠造模成功，對(duì)于達(dá)不到造模標(biāo)準(zhǔn)或死亡大鼠予以剔除并補(bǔ)充相應(yīng)數(shù)目大鼠以保證大鼠樣本量恒定。

1.4 處置方法

穴注組在造模成功后，參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[3]及《大鼠穴位圖譜的研制》[4]，定位大鼠百會(huì)穴及大椎穴，給予標(biāo)記，將天麻素溶液按0.37 mL/kg的給藥劑量分別注射入模型大鼠百會(huì)穴及大椎穴，連續(xù)治療28 d；西藥組在造模成功后，給予丙戊酸鈉溶液(350 mg/kg)灌胃，日1次，連續(xù)治療28 d。

1.5 取材

Morris水迷宮及八臂迷宮試驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)模型大鼠進(jìn)行麻醉、固定、斷頭等處理，將實(shí)驗(yàn)大鼠的腦組織海馬區(qū)迅速分離取材，將體積1 mm3大小組織塊置于2.5%戊二醛固定液中前固定，保存標(biāo)本，常規(guī)處理并按操作說明書以實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)COX-2 mRNA表達(dá)。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 全面強(qiáng)直發(fā)作-陣攣發(fā)作潛伏期和極小陣攣發(fā)作潛伏期 每次給予各組大鼠PTZ腹腔注射后，參照Racine分級(jí)，觀察大鼠極小陣攣發(fā)作(MCS)潛伏期及全面性強(qiáng)直-陣攣發(fā)作(GTCS)潛伏期[5]。

1.6.2 Morris水迷宮試驗(yàn) 對(duì)各組實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行Morris水迷宮試驗(yàn)檢測(cè)大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。最后1次治療結(jié)束后，每組大鼠再隨機(jī)選出10只大鼠進(jìn)行Morris水迷宮試驗(yàn)并記錄實(shí)驗(yàn)大鼠尋找并爬上平臺(tái)所需的時(shí)間以及穿越平臺(tái)象限的次數(shù)。

1.6.3 八臂迷宮試驗(yàn) 對(duì)各組大鼠進(jìn)行八臂迷宮試驗(yàn)檢測(cè)大鼠與海馬相關(guān)的工作記憶錯(cuò)誤和參考記憶錯(cuò)誤。治療結(jié)束后，各組大鼠再隨機(jī)選出10只大鼠進(jìn)行八臂迷宮試驗(yàn)，并記錄大鼠在八臂迷宮中的覓食情況，包括參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)、工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)、吃完食物所需總時(shí)間。

1.6.4 檢測(cè)COX-2 mRNA的表達(dá) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)COX-2 mRNA在大鼠海馬組織的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)大鼠海馬組織取材后，去RNA酶離心管中加入30 mg海馬組織，同時(shí)加入Trizol試劑1 mL，剪碎、迅速勻漿、氯仿抽提、振蕩混勻、離心、移入去RNA酶離心管。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果采用重復(fù)測(cè)量的多因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.01表示有差異顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

2.1.1 全面性強(qiáng)直-陣攣發(fā)作潛伏期(GTCS) 與模型組對(duì)比，穴注組及西藥組大鼠GTCS均顯著延長(zhǎng)(P<0.01)；穴注組與西藥組對(duì)比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？瞻捉M大鼠未出現(xiàn)癇性發(fā)作。

2.1.2 極小陣攣發(fā)作潛伏期(MCS) 與模型組對(duì)比，穴注組及西藥組大鼠MCS均顯著延長(zhǎng)(P<0.01)；穴注組與西藥組對(duì)比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？瞻捉M大鼠未出現(xiàn)癇性發(fā)作。見表1。

表1 各組戊四氮致癇大鼠全面強(qiáng)直發(fā)作-陣攣發(fā)作(GTCS)潛伏期和極小陣攣發(fā)作(MCS)潛伏期比較

2.2 各組Morris水迷宮試驗(yàn)比較

各組實(shí)驗(yàn)大鼠在Morris水迷宮中搜索平臺(tái)游泳軌跡策略如圖1所示，經(jīng)訓(xùn)練后，空白組大鼠游泳軌跡表現(xiàn)為直線式有效策略；模型組大鼠游泳軌跡表現(xiàn)為以隨機(jī)式為主，并且具極大盲目性；穴注組大鼠表現(xiàn)為趨向式的有效策略；西藥組以邊緣式為主。

圖1 各組大鼠在Morris水迷宮中搜索平臺(tái)游泳軌跡策略圖

模型組與空白組相比，實(shí)驗(yàn)大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；模型組大鼠與空白組相比，在空間探索試驗(yàn)中穿越平臺(tái)數(shù)明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；穴注組及西藥組大鼠與模型組相比，逃避潛伏期時(shí)間均較模型組明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),穿越平臺(tái)數(shù)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；穴注組與西藥組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 Morris水迷宮試驗(yàn)各組大鼠逃避潛伏期與穿越平臺(tái)次數(shù)比較

2.3 各組八臂迷宮試驗(yàn)比較

與空白組比較，模型組、穴注組、西藥組數(shù)據(jù)均有差異，參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)、工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)均顯著增多(P<0.01)，吃完食物總時(shí)間模型組及西藥組顯著增多(P<0.01)、穴注組增多(P<0.05)。穴注組及西藥組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠八臂迷宮試驗(yàn)比較

2.4 各組COX-2 mRNA在大鼠海馬組織表達(dá)比較

各組大鼠海馬組織COX-2 mRNA表達(dá)水平以β-actin作內(nèi)參。與空白組相比，模型組大鼠COX-2 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，穴注組、西藥組大鼠COX-2 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)；與模型組對(duì)比，穴注組、西藥組干預(yù)后均降低COX-2 mRNA的表達(dá)水平(P<0.05)；穴注組與西藥組對(duì)比，大鼠海馬胞漿內(nèi)COX-2 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4、圖2。

表4 各組大鼠海馬組織COX-2 mRNA表達(dá)

圖2 各組大鼠海馬組織COX-2 mRNA表達(dá)

3 討論

癲癇是在神經(jīng)功能紊亂疾病中所占比例最高的慢性臨床綜合征[6]，其中部分癲癇患者會(huì)伴隨有不同程度的認(rèn)知功能障礙以及學(xué)習(xí)記憶功能障礙，在學(xué)習(xí)記憶能力中又以視覺空間記憶能力以及長(zhǎng)、短時(shí)記憶能力損傷最為嚴(yán)重[7]。研究發(fā)現(xiàn)在癲癇治療方面，中藥單體及復(fù)方制劑發(fā)揮著非常重要的作用[7]。天麻為蘭科植物，具有熄風(fēng)定驚功效?！度杖A子本草》云:“助陽氣，補(bǔ)五勞七傷，通血脈，開竅?！薄侗窘?jīng)》記載:“主惡氣，久服益氣力，長(zhǎng)陰肥健?！爆F(xiàn)代研究表明天麻超微粉對(duì)血管性癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的降低有改善作用，可能與調(diào)節(jié)膽堿能系統(tǒng)促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的釋放有關(guān)[8]。另有研究發(fā)現(xiàn)天麻對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷所致血腦屏障滲漏及腦水腫均有減輕，可能通過減少神經(jīng)元丟失、膠質(zhì)細(xì)胞活化使神經(jīng)干細(xì)胞增殖，進(jìn)而改善損傷后導(dǎo)致的認(rèn)知及運(yùn)動(dòng)功能障礙[9]。王氏等總結(jié)多項(xiàng)研究證實(shí)天麻單藥具有緩解認(rèn)知障礙、神經(jīng)保護(hù)作用、抗阿爾茲海默病、抗氧化、抗驚厥、抗癲癇及腦保護(hù)作用[10]。穴位注射療法是在傳統(tǒng)毫針針刺基礎(chǔ)上發(fā)展而來，較以往傳統(tǒng)針刺療法，穴注可將提純藥物采用針刺輸注手段直接作用于穴位，臨床上取得更為理想療效。臨床上本研究團(tuán)隊(duì)已應(yīng)用天麻單藥及復(fù)方制劑治療癲癇及癲癇后伴認(rèn)知障礙患者多年，且通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)天麻素穴注可有效抑制癇性發(fā)作，并調(diào)控抗凋亡因子Bcl-2及凋亡因子Caspase-3的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用[11]。

本研究水迷宮試驗(yàn)顯示模型組大鼠潛伏期較空白組數(shù)據(jù)明顯延長(zhǎng)、穿越平臺(tái)數(shù)減少，八臂迷宮試驗(yàn)示模型組大鼠較空白組大鼠數(shù)據(jù)參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)和工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)均顯著增多、吃完食物總時(shí)間顯著延長(zhǎng)，證明造模后癲癇大鼠已經(jīng)出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力、工作記憶、參考記憶能力下降，存在認(rèn)知功能障礙的表現(xiàn)。穴注組和西藥組與模型組實(shí)驗(yàn)大鼠數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，潛伏期明顯縮短、穿越平臺(tái)次數(shù)增加、參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)、工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)均減少、吃完食物總時(shí)間縮短，表明穴注和西藥均可對(duì)癲癇大鼠認(rèn)知、記憶力有一定的改善作用。目前，在AEDs治療基礎(chǔ)上，添加中藥輔助治療癲癇已經(jīng)成為了一種研究和應(yīng)用的趨勢(shì)，本研究結(jié)果穴注組及西藥組兩組學(xué)習(xí)記憶能力數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但穴注組數(shù)據(jù)優(yōu)于西藥組，提示在后續(xù)研究中關(guān)注中藥不同劑量、干預(yù)治療時(shí)長(zhǎng)對(duì)癲癇大鼠認(rèn)知功能障礙的治療差異。

COX-2作為前列腺素E2代謝產(chǎn)生過程的關(guān)鍵酶和限速酶，前列腺素E2參與炎癥、凋亡等多種病理過程，COX-2主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，參與介導(dǎo)神經(jīng)元損傷[12-13]。在癲癇發(fā)作、炎癥反應(yīng)發(fā)生及腦外傷刺激后，COX-2能夠通過合成 PGE2進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞膜興奮性、增強(qiáng)細(xì)胞膜通透性及異常興奮性信號(hào)傳導(dǎo)而誘發(fā)細(xì)胞的損傷[14]。研究顯示應(yīng)用COX-2抑制劑能明顯抑制癲癇大鼠的癇性發(fā)作的發(fā)作頻率及發(fā)作持續(xù)時(shí)間，并且減輕腦組織損傷[15]。本研究發(fā)現(xiàn)戊四氮致癇大鼠海馬組織COX-2mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，由此推測(cè)，COX-2的異常表達(dá)可能參與了癲癇發(fā)病中的氧化應(yīng)激損傷以及海馬神經(jīng)元死亡或凋亡過程，天麻素可能通過調(diào)節(jié)COX-2的異常表達(dá)，進(jìn)而具有抗氧化損傷、抗凋亡的腦保護(hù)作用。

綜上所述，本研究證實(shí)天麻素穴注延長(zhǎng)戊四氮致癇大鼠GTCS潛伏期和MCS潛伏期、改善認(rèn)知功能，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié) COX-2的異常表達(dá)發(fā)揮其改善大鼠認(rèn)知障礙及神經(jīng)保護(hù)功能，該研究結(jié)果為臨床癲癇疾病的治療及改善癲癇后認(rèn)知障礙均提供了新的治療思路。