白冠長(zhǎng)尾雉源金黃色葡萄球菌的分離鑒定與敏感抗菌藥物的篩選

王光鋒 李 舫

(山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，濰坊，261061)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)隸屬于葡萄球菌屬，是革蘭氏陽(yáng)性菌代表，大部分金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生腸毒素(staphylococcal enterotoxins，SEs)、殺白細(xì)胞素和剝脫毒素等毒性蛋白[1]，進(jìn)而引起食物中毒、蜂窩織炎、腸炎、敗血癥、過(guò)敏性疾病及自身免疫性疾病等[2]，還可以引起雞、鴨、鵝、豬、牛、兔等多種家禽、家畜發(fā)病。家禽感染主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎、腱鞘炎、腳墊腫、臍炎和葡萄球菌性敗血癥[3-4]等。該菌在自然界分布廣泛，一年四季均可發(fā)生，為臨床重要的人獸共患病病原菌。

白冠長(zhǎng)尾雉(Syrmaticusreevesii)屬于雞形目(Galliformes)，雉科(Phasianidae)，是中國(guó)特產(chǎn)珍禽，屬國(guó)家Ⅱ級(jí)保護(hù)動(dòng)物。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于白冠長(zhǎng)尾雉的研究主要集中在種群數(shù)量調(diào)查、人工飼養(yǎng)繁殖、生理生化習(xí)性以及生態(tài)學(xué)等方面[5]，關(guān)于白冠長(zhǎng)尾雉疾病防治的研究較少。2019年5月，山東濰坊某動(dòng)物園的白冠長(zhǎng)尾雉發(fā)生一種急性疾病，病雉食欲下降、精神沉郁、關(guān)節(jié)腫脹、跛行，眼瞼有膿性分泌物。剖檢可見(jiàn)肝臟腫大，有黃白色點(diǎn)狀壞死灶；脾臟腫大，呈紫紅色；關(guān)節(jié)有膠胨樣滲出物。本試驗(yàn)從送檢白冠長(zhǎng)尾雉病死病料中分離到1株細(xì)菌，通過(guò)細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)方法鑒定為金黃色葡萄球菌，篩選了敏感藥物，為該病的防治提供了依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病料來(lái)源

無(wú)菌采集動(dòng)物園病死白冠長(zhǎng)尾雉的肝臟、關(guān)節(jié)滲出液等組織。

1.2 主要試劑

腦心浸出液(BHI)液體培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、Baird-Parker瓊脂(BP)、革蘭氏染液購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；CM304凍干兔血漿購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；藥敏試紙片、微量生化發(fā)酵管購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自杭州昊鑫生物科技股份有限公司；PCR試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 細(xì)菌的分離與培養(yǎng)

將無(wú)菌采集的肝臟和關(guān)節(jié)滲出液病料，劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，37 ℃倒置培養(yǎng)18—24 h，觀察菌落形態(tài)，挑取單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落，進(jìn)行細(xì)菌的純化。取典型菌落接種鑒別培養(yǎng)基Baird-Parker瓊脂，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)特征。

1.4 細(xì)菌形態(tài)學(xué)鏡檢

將純化的細(xì)菌培養(yǎng)后，挑取單菌落，制備標(biāo)本片進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.5 細(xì)菌生化鑒定

將初步鑒定為金黃色葡萄球菌的菌株，接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂37 ℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行生化鑒定和血漿凝固酶試驗(yàn)。血漿凝固酶的檢測(cè)采用兔血漿凝固法，操作方法如下：將分離菌接種至含BHI培養(yǎng)基的試管中37 ℃培養(yǎng)16 h，用生理鹽水將凍干兔血漿1∶4稀釋，取0.5 mL稀釋后的兔血漿加入小試管中，再加0.3 mL上述培養(yǎng)的細(xì)菌液，兩者混合均勻后置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，每間隔0.5 h觀察1次結(jié)果。若6 h內(nèi)小試管中兔血漿和細(xì)菌培養(yǎng)物出現(xiàn)凝固或凝固體積大于原體積的一半，則判定為血漿凝固酶陽(yáng)性[6-7]。同時(shí)做已知樣品的陽(yáng)性、陰性對(duì)照。

1.6 16S rRNA基因檢測(cè)

根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明提取分離菌的基因組DNA。采用已報(bào)道的通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、1492R：5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′，對(duì)分離菌株16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增DNA片段大小為1 504 bp。PCR反應(yīng)用30 μL反應(yīng)體系，制備好的細(xì)菌基因組DNA 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×PCR Magic Mix 3.0 15 μL，滅菌水11 μL，瞬時(shí)離心混勻。反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s、55 ℃變性45 s、72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果并將PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST分析。

1.7 致病性試驗(yàn)

將20只健康成年雞(Gallusgallus)隨機(jī)分為2組，試驗(yàn)組每只雞皮下接種1 mL培養(yǎng)至15 h的分離菌株肉湯培養(yǎng)物(用生理鹽水調(diào)到1×108cfu/mL)；對(duì)照組每只接種1 mL的生理鹽水。連續(xù)觀察7 d，每天記錄發(fā)病死亡情況，死亡雞剖檢并進(jìn)行細(xì)菌的分離。

1.8 藥物敏感性試驗(yàn)

取純培養(yǎng)的新鮮菌液接種平板，每個(gè)平板接種50 μL，用滅菌L棒均勻涂布，用無(wú)菌鑷子夾取各種抗菌藥物紙片貼在培養(yǎng)基表面，每個(gè)平板貼7張藥敏紙片，每張紙片間距不少于20 mm，紙片中心距平皿邊緣不少于15 mm，貼好后倒置于37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)鏡檢結(jié)果

病雉肝臟、關(guān)節(jié)滲出液病料接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上均形成中等大小，表面光滑，邊緣整齊，初呈灰白色，繼而為金黃色不透明的菌落。在Baird-parker瓊脂上形成圓形、光滑濕潤(rùn)、灰黑色的菌落，菌落周圍有一混濁帶，外層有一透明圈。鏡檢可見(jiàn)單個(gè)、成雙、短鏈或堆狀的藍(lán)紫色球狀細(xì)菌。

2.2 細(xì)菌生化試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明分離菌株能分解乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇，甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性，V-P試驗(yàn)陰性，還原硝酸鹽，不產(chǎn)生靛基質(zhì)，H2S試驗(yàn)陰性，可產(chǎn)生血漿凝固酶，與報(bào)道的金黃色葡萄球菌的生化特性一致[8]。

2.3 致病性試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組接種細(xì)菌后24 h出現(xiàn)精神沉郁、食欲下降，接種部位皮膚破潰、關(guān)節(jié)腫脹，72 h 開(kāi)始死亡，接種后7 d試驗(yàn)雞發(fā)病率為100%(10/10)，死亡率為70%(7/10)。死亡雞剖檢病變主要為肝、脾出血，從病變組織分離到細(xì)菌，經(jīng)鑒定為金黃色葡萄球菌。對(duì)照組無(wú)明顯癥狀。

2.4 PCR檢測(cè)結(jié)果

分離菌株基因組DNA利用16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小約為1 500 bp的目的片段，與預(yù)期片段大小相符(圖1)。測(cè)序結(jié)果在GenBank進(jìn)行Blast比對(duì)，與其同源性最高的均為金黃色葡萄球菌各株系的16S rRNA序列，同源性達(dá)到99.2%以上，進(jìn)一步證實(shí)分離菌株為金黃色葡萄球菌。

圖1 分離菌株P(guān)CR鑒定Fig.1 PCR identification of the isolated strain 注：M：DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1：分離菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 Note：M，DNA ladder marker DL2000.1，PCR amplification product of isolated strain

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株對(duì)米諾環(huán)素、大觀霉素、萬(wàn)古霉素、苯唑西林、哌拉西林、妥布霉素、頭孢類藥物等15種藥物敏感；對(duì)卡那霉素、氨芐西林、四環(huán)素、左氟沙星、鏈霉素、慶大霉素6種藥物中介；對(duì)青霉素、環(huán)丙沙星、氨曲南等11種藥物耐藥(表1)。

3 討 論

白冠長(zhǎng)尾雉數(shù)量稀少，為全球性易危物種。為了保護(hù)這一物種，國(guó)內(nèi)學(xué)者已經(jīng)對(duì)其生態(tài)學(xué)、行為學(xué)等方面進(jìn)行了深入研究[9]，但關(guān)于其疾病防治，目前只有白冠長(zhǎng)尾雉感染雞異刺線蟲(chóng)(Heterakisgallinae)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)等的報(bào)道[10-12]。本試驗(yàn)從動(dòng)物園發(fā)病的白冠長(zhǎng)尾雉肝臟、關(guān)節(jié)滲出液病料中分離到1株細(xì)菌，經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)、形態(tài)鏡檢、生化試驗(yàn)、16S rRNA序列分析鑒定為金黃色葡萄球菌。通過(guò)致病性試驗(yàn)，證實(shí)分離菌對(duì)健康成年雞有較強(qiáng)的致病作用，并從人工感染的雞體內(nèi)再次分離到金黃色葡萄球菌，證實(shí)該動(dòng)物園白冠長(zhǎng)尾雉發(fā)病是由金黃色葡萄球菌感染所致，為國(guó)內(nèi)首次報(bào)道。

金黃色葡萄球菌是多種動(dòng)物的病原菌，該菌抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可以通過(guò)產(chǎn)生水解酶(β-內(nèi)酰胺酶)滅活抗生素，也可以通過(guò)改變藥物作用的靶位結(jié)構(gòu)，降低抗生素的敏感性[13]。本文藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株對(duì)米諾環(huán)素、大觀霉素、頭孢類藥物等15種藥物敏感；對(duì)卡那霉素、氨芐西林、四環(huán)素、左氟沙星、鏈霉素、慶大霉素6種藥物中介；對(duì)青霉素、環(huán)丙沙星、氨曲南等11種藥物耐藥，說(shuō)明該分離株耐藥性已較嚴(yán)重。所以當(dāng)動(dòng)物發(fā)生該病時(shí)，應(yīng)通過(guò)藥敏試驗(yàn)選擇敏感有效的藥物，合理使用，以提高治療療效。

表1 分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

金黃色葡萄球菌對(duì)外界環(huán)境抵抗力較強(qiáng)，常因氣候突變、皮膚傷口感染、驅(qū)趕或注射疫苗等應(yīng)激因素影響，引起動(dòng)物發(fā)病。所以動(dòng)物園要加強(qiáng)珍禽飼養(yǎng)區(qū)的管理，及時(shí)清理糞便、清潔用具，對(duì)飼養(yǎng)工具定期消毒，搞好環(huán)境衛(wèi)生，以降低葡萄球菌病的發(fā)生。