毛干DNA提取中四種細(xì)菌清除方法的比較研究

周永恒 馬 躍，2 崔靚玉 徐艷春，2，3 楊淑慧*

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040；2.國家林業(yè)和草原局野生動(dòng)植物檢測(cè)中心，哈爾濱，150040；3.國家林業(yè)和草原局野生動(dòng)物保護(hù)與利用工程技術(shù)研究中心，哈爾濱，150040)

毛發(fā)是一種最常見、易存儲(chǔ)、抗污染能力強(qiáng)的生物材料[1-2]，含有多態(tài)性蛋白質(zhì)、激素和DNA等，可以提供動(dòng)物個(gè)體的生物學(xué)信息[3-5]。其中DNA所能夠提供的遺傳信息最為豐富，不僅用于物種鑒定，還可用來推斷系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、分析種群遺傳結(jié)構(gòu)、追溯個(gè)體間的血緣關(guān)系等[6-7]。但是這些信息的挖掘潛力受限于DNA的質(zhì)和量，DNA質(zhì)量越低實(shí)驗(yàn)分析越困難。

毛發(fā)與其他組織一樣，具有核DNA(nuDNA)和線粒體DNA(mtDNA)。毛干形成后期主要是細(xì)胞的角化，這一過程伴隨著nuDNA的降解，除了角蛋白合成有關(guān)的基因以外，其他的部分逐漸斷裂、降解、消失[5]。最后存留的DNA片段很小，而且含量極低。mtDNA的拷貝數(shù)是nuDNA的數(shù)百倍，且處于細(xì)胞質(zhì)的線粒體中，保存的機(jī)會(huì)較高[5]。因此，通常情況下，可以從毛干角化組織中獲得足夠的mtDNA用于PCR擴(kuò)增[8]，而nuDNA則非常困難。雖然經(jīng)過大量嘗試，對(duì)于nuDNA上遺傳標(biāo)記的分析仍然達(dá)不到穩(wěn)定、可靠，除了PCR擴(kuò)增成功率低以外，還可能出現(xiàn)等位基因缺失和雜峰等問題[9-12]，因此，人們普遍認(rèn)為毛干中提取的DNA不能用于核遺傳標(biāo)記的分析。

我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，造成這種情況的主要原因還是在于提取效率低下。我們改進(jìn)了提取方法，從毛干中得到的DNA可用于微衛(wèi)星等核基因的分析(另文報(bào)道)，但是無法用于基因組的測(cè)序。主要原因是毛干DNA中混有大量的細(xì)菌DNA，其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過動(dòng)物DNA。這些細(xì)菌DNA主要來自毛發(fā)表面和經(jīng)斷裂處進(jìn)入髓質(zhì)的環(huán)境細(xì)菌。只要有效去除細(xì)菌DNA，有效富集動(dòng)物DNA，就可以在高通量測(cè)序中獲得足夠的動(dòng)物序列。

去除細(xì)菌DNA可以有兩種途徑：一是把毛發(fā)在提取DNA之前徹底清洗，去除細(xì)菌；二是在獲得DNA之后，把細(xì)菌DNA分離出去。第二種途徑通常采用甲基化抗體包被的磁珠，特異性地吸附甲基化豐富的動(dòng)物DNA，而不吸附甲基化缺乏的細(xì)菌DNA，從而達(dá)到分離目的。但是這一方法一方面費(fèi)用十分昂貴，另一方面，操作過程涉及多次移液，會(huì)損失大量的動(dòng)物DNA。因此，清除細(xì)菌是最為便捷、便宜的途徑。目前清洗毛發(fā)的方法有很多，一般常用的方法是用加酶洗衣粉溶液浸泡、沖洗毛發(fā)，然后以無菌水漂洗，再用70%—75%的酒精浸泡[13]。洗衣粉溶液也可以用日用洗發(fā)水溶液替代。但這些方法清除細(xì)菌不徹底，黏附于鱗片內(nèi)側(cè)和進(jìn)入毛干內(nèi)部的細(xì)菌無法清除。

我們建立了一種清洗毛發(fā)的方法，能夠高效、快速地去除毛干上的細(xì)菌，且對(duì)下游DNA的提取影響不大。這種方法采用常規(guī)試劑和儀器，成本低廉，便于推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 毛發(fā)樣品及其預(yù)處理

實(shí)驗(yàn)前將所有的剪刀、刀片、鑷子、玻璃器皿等先清洗干凈，用高壓滅菌鍋滅菌，放入烘箱中60 ℃烘干備用。取1張常溫、常濕下保存的藍(lán)狐(北極狐，Vulpeslagopus)生皮，在皮張背部用打毛剪從根部剪取毛發(fā)約2 g放入燒杯中，加入1%的洗衣粉溶液(雕牌含酶洗衣粉)100 mL，用無菌玻璃棒攪拌2 min，轉(zhuǎn)移到新的無菌燒杯中，加入無菌去離子水清洗2遍。移入75%的酒精中浸泡10 min，放到無菌的培養(yǎng)皿中，超凈工作臺(tái)上將水分自然蒸干(也可以用鼓風(fēng)式烘箱加速水分蒸發(fā))。用鋁箔紙密封，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細(xì)菌的清洗

用CP513型電子天平(OHAUS，美國)稱15份毛發(fā)樣品，每份7 mg，分別移入15個(gè)無菌的1.5 mL離心管中。本實(shí)驗(yàn)使用4種不同的處理方法來處理毛發(fā)樣本，每種處理方法做3個(gè)重復(fù)，標(biāo)記為I(I#1、I#2、I#3)—IV(IV#1、IV#2、IV#3)，最后一組V(V#1、V#2、V#3)作為對(duì)照組，清洗之后未加處理。毛干操作步驟如下。

1.2.1 取500 μL SDS溶液(10%)和500 μL NaOH溶液(4 mol/L)加入試管I中，短暫震蕩30 s，室溫放置15 min，小心移去液體，加入1 000 μL無菌去離子水，震蕩30 s，移去液體，重復(fù)漂洗1次，移去液體。把毛干移入新的試管，加入1 000 μL 95%的乙醇保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 取1 000 μL溶菌酶溶液(30 mg/mL)加入試管II中，震蕩30 s，隨后置于37 ℃水浴鍋中水浴45 min，移去液體，用1 000 μL無菌去離子水漂洗2遍，再加入1 000 μL 1%的SDS溶液，置于99 ℃水浴中孵育15 min，取出后移除液體，加入無菌的去離子水漂洗2遍，去除液體。向試管III中加入1 000 μL 1%的triton X-100[14]，將試管III置于99 ℃水浴中孵育15 min，取出后移除液體，加入無菌的去離子水漂洗2遍，去除液體，移入新管，以95%乙醇浸泡保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 向試管IV中加入1 000 μL的1.5%SDS溶液，短暫震蕩30 s，置于65 ℃水浴中40 min，移去液體，隨后將毛干放入裝有65 ℃ 4 mol/L的NaOH溶液的試管中，用鑷子夾住毛發(fā)，上下擺動(dòng)，20 s后，迅速拿出，用去離子水沖洗3遍。移入新管，以95%乙醇浸泡保存?zhèn)溆谩?/p>

為了進(jìn)一步驗(yàn)證NaOH溶液處理的有效性，增加兩組實(shí)驗(yàn)，將處理時(shí)間從20 s延長到35 s和50 s，其他處理過程不變，樣本分別標(biāo)記為IV(IV#135、IV#235、IV#335)，IV(IV#150、IV#250、IV#350)。

1.3 DNA的提取

在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將毛發(fā)樣品取出室溫下放置5 min以上，使乙醇自然揮發(fā)。轉(zhuǎn)至1.5 mL的無菌離心管內(nèi)，按原樣編號(hào)。用剪刀把樣品剪碎，每個(gè)試管中加入400 μL TNE緩沖液(10 mmol/L Tris-HCL、10 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl，pH=8)、45 μL蛋白酶K(10 mg/mL)、45 μL DTT(0.15 mol/L)和35 μL SDS(10%)，稍微震蕩混勻，56 ℃水浴中消化4 h后，再加入30 μL 10 mg/mL的蛋白酶K，繼續(xù)消化3 h，隨后使用動(dòng)植物基因組磁珠法提取試劑盒(中科雷鳴，中國北京)進(jìn)行提取，具體操作步驟見說明書。

1.4 提取DNA的驗(yàn)證

為了確定提取成功，以藍(lán)狐mtDNA上一個(gè)142 bp的片段和細(xì)菌pDNA上一個(gè)187 bp的片段為標(biāo)記，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。pDNA擴(kuò)增引物Np為F：5′-CATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATC-3′，R：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGACTTC-3′；mtDNA片段擴(kuò)增引物Nmt為F：5′-CACGTCGTATACCAACGCCT-3′，R：5′-GG- GTTGTCCTAGGAGTGCAAA-3′；2對(duì)引物的Tm均為56 ℃，可采取同樣的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序。

擴(kuò)增反應(yīng)在10 μL體系中進(jìn)行，PCR反應(yīng)體系含有2×RapidTaqMaster Mix(南京維諾贊生物科技有限公司)5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.3 μL，DNA模板2 μL，去離子水2.4 μL?；靹蚝笏矔r(shí)離心，用9700型PCR擴(kuò)增儀(GeneAmp，美國)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，35個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸5 min。采用同樣的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序。

從2個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中各取1.5 μL的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行混合，在1.5%瓊脂糖膠進(jìn)行電泳分離，電泳緩沖液為1×TAE，100 V下電泳22 min。

1.5 動(dòng)物DNA和細(xì)菌DNA豐度的變化

為了檢測(cè)不同處理方法對(duì)細(xì)菌清除的效果，以動(dòng)物的mtDNA和細(xì)菌的質(zhì)粒DNA(pDNA)為目標(biāo)，通過相對(duì)熒光定量PCR方法分別測(cè)定相對(duì)Ct值。mtDNA的擴(kuò)增引物(Nmt)和pDNA的擴(kuò)增引物(Np)仍采用前述引物。為了提高擴(kuò)增的特異性，將Tm都提升到60 ℃。二者的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件相同。

PCR擴(kuò)增體系為10 μL，包括1 μL DNA溶液、5 μL TB Green Premix ExTaqII(Takara，大連)，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL和3.2 μL去離子水。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 s。反應(yīng)用CFX384 Real-Time System 熒光定量儀(BIO-RAD，美國)完成，在每一個(gè)循環(huán)延伸步驟結(jié)束后立即收集熒光信號(hào)并顯示結(jié)果。

用mtDNA的Ct值(Ctm)與細(xì)菌pDNA的Ct值(Ctb)的比值及它們Ct值的變化情況作為衡量細(xì)菌清除效果的標(biāo)準(zhǔn)，比值越低，pDNA的Ct值升高的越多，說明細(xì)菌的pDNA拷貝數(shù)越少，處理效果越好。

2 結(jié)果

2.1 DNA提取效果的定性檢驗(yàn)

為了驗(yàn)證上述實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)成功獲得了毛干DNA，以提取的DNA溶液作為模板，擴(kuò)增藍(lán)狐mtDNA上142 bp的片段和細(xì)菌pDNA上187 bp的片段。如圖1，所有的處理都可以同時(shí)擴(kuò)增出2個(gè)目的片段，說明這些處理中都成功提取到DNA，但都沒有把細(xì)菌完全消除干凈。泳道5上除了2條目的片段之外，還在下面出現(xiàn)了明顯的引物二聚體，而且目的片段的信號(hào)強(qiáng)度比前幾個(gè)泳道有所降低，尤其是細(xì)菌pDNA的片段信號(hào)衰減相對(duì)明顯，說明所提取的DNA總量有所減小，細(xì)菌DNA的量減少更明顯。

2.2 不同處理方法對(duì)細(xì)菌清除效果的定量檢測(cè)

引物Nmt和Np的熔解曲線如圖2所示，它們的熔點(diǎn)峰值分別為82.5 ℃和87 ℃左右，熔解曲線峰值點(diǎn)高度重合，且僅有1個(gè)峰值點(diǎn)，說明引物無二聚體，無非特異性擴(kuò)增及其他外源DNA污染，引物設(shè)計(jì)完全符合實(shí)驗(yàn)要求，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性。

圖1 藍(lán)狐毛干在4種方法處理下mtDNA和細(xì)菌pDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖Fig.1 Electrophoretic gram of amplicons of mtDNA and bacterial pDNA using DNA extracted from blue fox hair shaft cleaned with 4 different methods 注：M為DL2000 DNA marker；泳道1—3為樣本I#1—III#1；泳道4為對(duì)照樣本V#1；泳道5為樣本IV#1在65 ℃的4 mol/L NaOH中保留20 s Note：M is DL2000 DNA marker.Lane 1-3 are sample I#1-I#3.Lane 4 is control sample V#1.Lane 5 is sample IV#1 treated 4 mol/L NaOH at 65 ℃ for 20 s

圖2 引物Np和Nmt的熔解曲線Fig.2 Melt curves of primers Np and Nmt

采用熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)處理的毛干(V#1—V#3樣本)中提取的總DNA中，mtDNA與細(xì)菌pDNA的Ct值分別是(15.53±0.15)、(16.82±0.03)，其比值為(0.923±0.009)。以這一比值為基準(zhǔn)評(píng)估不同方法清洗后質(zhì)粒DNA的數(shù)量變化。結(jié)果顯示，在常溫下經(jīng)過SDS和NaOH雙重處理、溶菌酶處理以及Triton X-100處理，I—III樣品中mtDNA的Ct值分別為(17.86±0.42)、(16.15±0.48)和(16.23±0.45)；pDNA的Ct值為(16.98±0.10)、(17.02±0.18)和(17.14±0.14)。mtDNA與pDNA的Ct值之比均接近對(duì)照組的水平，分別為(1.052±0.026)、(0.949±0.037)和(0.947±0.033)。這表明這3種處理方法都未能有效洗脫毛發(fā)上的細(xì)菌。當(dāng)把樣品在65 ℃的NaOH中保留20 s，mtDNA和pDNA的Ct值分別為(23.653±0.036)和分別為(26.6±0.345)，二者之間的比值為(0.889±0.01)，pDNA的Ct值有明顯變化，平均提高了(9.8±0.395)，說明這一處理方法使細(xì)菌DNA的拷貝數(shù)明顯下降，而mtDNA的相對(duì)比例也有所提高，二者的差異擴(kuò)大了近10倍。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證NaOH溶液中處理的時(shí)間對(duì)細(xì)菌DNA清除效果的影響，在20 s的基礎(chǔ)上，分別延長到35 s和50 s，其他實(shí)驗(yàn)步驟不變。結(jié)果顯示，當(dāng)處理時(shí)間延長到35 s時(shí)，其中一個(gè)樣本(IV#135)的mtDNA和pDNA均無數(shù)值顯示，另外兩組(IV#235，IV#335)的mtDNA的Ct值分別達(dá)到25.53和26.45，pDNA的Ct值分別為28.50和30.22，較處理20 s相比，分別提升了(2.33±0.42)和(2.85±0.43)，這說明將溫度提升到35 ℃時(shí)，此方法對(duì)細(xì)菌DNA和mtDNA的影響基本相一致，還可能導(dǎo)致提取失敗。當(dāng)處理時(shí)間延長到50 s時(shí)，在DNA洗脫過程中，磁珠由原來的分散狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟蹱顟B(tài)，反復(fù)震蕩也無法分散，使后續(xù)步驟無法進(jìn)行。所以，就目前的方案而言，最佳處理時(shí)間為20 s左右即可。

圖3 4種處理方法(I—IV)與對(duì)照組(V)mtDNA和pDNA的Ct值的比較Fig.3 Comparison of the Ct values of mtDNA and pDNA among the four cleaning methods and the control group

3 討論

由于毛干具有穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)、取材便利及易保存等特點(diǎn)[7]，人們將其視為獲取動(dòng)物DNA的重要來源。很多文獻(xiàn)報(bào)道使用從毛干中提取的DNA做PCR擴(kuò)增時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果大都不盡人意，尤其是nuDNA擴(kuò)增的成功率極低。雖然人們從提取方法、擴(kuò)增條件等方面進(jìn)行優(yōu)化，但也難以獲得有效提升[9，15]。

本研究首先評(píng)估了毛發(fā)經(jīng)過普通清洗后(樣本V)，獲得的總DNA可以同時(shí)擴(kuò)增出mtDNA和細(xì)菌pDNA的目的片段，顯示二者同時(shí)存在(圖1)。熒光定量PCR的檢測(cè)顯示，mtDNA和pDNA的Ct均值分別為(15.53±0.15)和(16.82±0.03)，二者的比值為(0.923±0.009)。說明細(xì)菌DNA的數(shù)量與動(dòng)物的mtDNA相差不多。因?yàn)閚uDNA比mtDNA低至少3個(gè)數(shù)量級(jí)[16]，所以如果細(xì)菌DNA在總DNA中占優(yōu)勢(shì)，nuDNA的擴(kuò)增效率就會(huì)受到顯著影響。因此在DNA提取之前清除細(xì)菌是非常必要的。

我們以樣本V為基準(zhǔn)測(cè)試了4種處理方案的效果。方案I中采用去垢劑SDS和NaOH處理，期望通過陰離子表面活性劑和NaOH共同對(duì)細(xì)菌進(jìn)行裂解，但是pDNA和mtDNA的拷貝數(shù)并未發(fā)生差分。方案II中采用溶菌酶來裂解細(xì)菌，達(dá)到消除的目的。但是雖經(jīng)長時(shí)間的作用(45 min)，也沒有把pDNA和mtDNA的拷貝數(shù)進(jìn)行有效差分，說明溶菌酶的作用效率不高。方案III中采用了非離子表面活性劑triton X-100提高體系的浸潤性和細(xì)菌的洗脫效果，但也沒有獲得滿意的效果。方案IV中采用了熱的高濃度NaOH(65 ℃，4 mol/L)短時(shí)間作用(20 s)，達(dá)到了2種DNA的有效差分，pDNA的拷貝數(shù)下降了3個(gè)數(shù)量級(jí)而使動(dòng)物DNA成為優(yōu)勢(shì)(圖3)。

以上結(jié)果說明，第一，細(xì)菌對(duì)毛干的黏附力很強(qiáng)，采用洗衣粉溶液、陰離子去垢劑和堿液等一般的方法無法徹底清除；第二，細(xì)菌的裂解比較困難，溶菌酶等溫和條件不能達(dá)到滿意效果，只有通過熱的強(qiáng)堿溶液才能裂解，并從毛干上脫落下來。

然而，延長強(qiáng)堿的處理時(shí)間(從20 s延長到35 s和50 s)未能獲得更好的效果，相反，還嚴(yán)重影響了DNA提取效率，甚至引發(fā)了磁珠的凝聚。推測(cè)可能有兩個(gè)原因，一是在較高溫度下延長作用時(shí)間之后，強(qiáng)堿破壞了毛干結(jié)構(gòu)并進(jìn)入毛干，裂解了殘存的DNA；二是強(qiáng)堿進(jìn)入毛干后，在下游的漂洗步驟中不能有效漂洗出來，強(qiáng)堿被帶入磁珠捕獲步驟，改變了磁珠表面性質(zhì)，引發(fā)凝集。

綜上所述，采用熱的強(qiáng)堿溶液可以有效清除毛干上的細(xì)菌DNA，65 ℃時(shí)最佳處理時(shí)間在20 s左右。雖然未對(duì)溫度進(jìn)行梯度測(cè)試，但也不推薦使用65 ℃以上的高溫，避免強(qiáng)堿對(duì)毛干和DNA的降解作用過于激烈。另外，本研究僅測(cè)試了藍(lán)狐的毛干，包括針毛和絨毛。但是，哺乳動(dòng)物毛發(fā)結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成大同小異，應(yīng)該具有普遍意義。而鹿科(Cervidae)動(dòng)物的毛干屬于薄壁中空的結(jié)構(gòu)，承受強(qiáng)堿作用的能力較低，作用時(shí)間可能更要縮短，需要另行摸索。