基于非靶向代謝組學(xué)的大熊貓主食竹代謝產(chǎn)物分析

吳海蘭 潘 欣* 余中亮 何永果 李才武 鄒立扣 黃 炎 張和民 劉春華 何 鳴

(1.成都理工大學(xué)旅游與城鄉(xiāng)規(guī)劃學(xué)院，成都，610059；2.中國(guó)大熊貓保護(hù)研究中心，都江堰，611830；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院，成都，611130)

大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)作為我國(guó)“國(guó)寶”級(jí)的珍稀瀕危物種，主要棲息于中國(guó)四川、甘肅和陜西的部分山區(qū)，截至2013年底，野生大熊貓種群數(shù)量約1 864只，2019年底圈養(yǎng)大熊貓達(dá)到了600余只。竹類(lèi)作為大熊貓攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要食物來(lái)源，主要包括竹葉、竹筍以及竹莖。由于大熊貓保留了食肉動(dòng)物消化系統(tǒng)特征，而竹類(lèi)纖維素較高，這使得大熊貓對(duì)其具有較低的消化率。為維持機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育所需的能量和營(yíng)養(yǎng)，野生大熊貓會(huì)隨著季節(jié)不同而采食竹子的不同部位[1-3]。竹類(lèi)中的有機(jī)化合物以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是大熊貓生長(zhǎng)發(fā)育的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此，對(duì)大熊貓主食竹的研究至關(guān)重要[4-5]。

代謝組學(xué)是對(duì)有機(jī)體代謝物進(jìn)行定量分析，并尋找代謝物與生理和病理變化相對(duì)關(guān)系的研究。按研究的目的，代謝組學(xué)又可分為靶向和非靶向，其中非靶向代謝組學(xué)能從整體反映代謝物的變化，全面地挖掘小分子代謝物，有利于發(fā)現(xiàn)新的代謝物和新的代謝通路[6]。Jensen等[7]通過(guò)非靶向代謝組學(xué)分析激酶抑制劑索拉非尼對(duì)心臟代謝存在的影響，研究證明預(yù)防的干預(yù)措施可有助于減輕索拉非尼引起的心臟損傷。李鑫磊等[8]探究白茶的代謝物特征及其形成的加工學(xué)原理，利用非靶向代謝組學(xué)將白茶與綠茶、烏龍茶和紅茶代謝產(chǎn)物特征進(jìn)行比較，結(jié)果表明白茶中大部分黃酮醇或黃酮糖苷類(lèi)物質(zhì)顯著高于其他茶類(lèi)。

近年來(lái)，越來(lái)越多研究關(guān)注于大熊貓主食竹的營(yíng)養(yǎng)成分等分析，如主食竹中氨基酸含量及其相互間比例的分析[9]，主食竹中有機(jī)養(yǎng)分分析[10]以及主食竹不同部位的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值比較[11]等。但鮮有主食竹代謝物產(chǎn)物差異性分析，鑒于此，本文采用LC-MS技術(shù)，分析竹子不同部位的差異性，鑒定竹子不同部位顯著差異成分，為研究大熊貓對(duì)主食竹不同部位的選擇提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

收集圈養(yǎng)大熊貓3種主食竹，包括苦竹(Pleioblastusamarus)、方竹(Chimonobambusaquadrangularis)、刺竹子(Chimonobambusapachystachys)，共63個(gè)樣品，包括竹筍、竹葉和竹桿樣品各21個(gè)。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-雙分壓線性阱-靜電場(chǎng)軌道阱串聯(lián)質(zhì)譜儀(UHPLC-LTQ Orbitrap，賽默飛世爾科技公司)、恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器(KQ-300GDV，昆山超聲儀器公司)、純水系統(tǒng)(Milli-QAdvantageA10，德國(guó)Merck Millipore公司)、冷凍干燥機(jī)(7754070，美國(guó)LABCONCO公司)、精密天平(MC京制00000246，德國(guó)Sartorius公司)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(5430R，德國(guó)Eppendorf公司)和渦旋振蕩器(G560E，美國(guó)Scientific Industries公司)。

1.3 前處理方法

稱(chēng)取100 mg樣本，加入20 μL內(nèi)標(biāo)(L-2-氯苯丙氨酸，0.3 mg/mL，甲醇配置)和0.6 mL的甲醇∶水(v∶v=7∶3)；在-20 ℃放置2 min預(yù)冷，加入研磨機(jī)(60 Hz，2 min)；超聲取30 min；-20 ℃靜置20 min；離心15 min(13 000 rpm，4 ℃)；取200 μL上清裝入帶內(nèi)襯管的LC-MS進(jìn)樣小瓶中。

1.4 色譜條件

色譜條件為：色譜柱為 BEH C18 柱(100 mm × 2.1 mm i.d.，1.7 μm；Waters，Milford，USA)；正離子模式：流動(dòng)相A為水(含0.1%甲酸)，流動(dòng)相B為乙腈(含0.1%甲酸)；負(fù)離子模式：流動(dòng)相A為水(含5 mM甲酸銨)，流動(dòng)相B為乙腈(含5mM甲酸銨)。梯度洗脫程序?yàn)?—1.5 min：5%—25% B，1.5—10.0 min：25%—100% B，10.0—13.0 min：100% B，13.0—13.5 min：100%—5%，5%B維持1.0 min。流速為0.40 mL/min，進(jìn)樣量為3 μL，柱溫為45 ℃。

1.5 質(zhì)譜條件

樣品質(zhì)譜信號(hào)采集分別采用正負(fù)離子掃描模式，電噴霧毛細(xì)管電壓、進(jìn)樣電壓和碰撞電壓分別為3.5 kV、40 V和40 eV。毛細(xì)管和離子溫度分別為350 ℃，載氣流量為45 L/h，質(zhì)譜掃描范圍為50—1 000 m/z，分辨率為30 000。

1.6 數(shù)據(jù)處理

將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入代謝組學(xué)處理軟件 Progenesis QI(Waters Corporation，Milford，USA)進(jìn)行基線過(guò)濾、峰識(shí)別、積分、保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊和歸一化，最終得到保留時(shí)間、質(zhì)荷比和峰強(qiáng)度的數(shù)據(jù)矩陣，將處理的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P軟件，進(jìn)行主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘-判別分析(OPLS-DA)等多元統(tǒng)計(jì)分析，再根據(jù)變量對(duì)分組貢獻(xiàn)值(VIP)的大小和組間變化的顯著性(P<0.05)進(jìn)行差異性代謝產(chǎn)物的篩選。鑒別差異代謝物的主要數(shù)據(jù)庫(kù)為 http：//www.hmdb.ca/等公共數(shù)據(jù)庫(kù)，最后利用 MetaboAnalyst平臺(tái)進(jìn)行聚類(lèi)熱圖和代謝通路分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹子各部位的色譜圖

通過(guò)在正、負(fù)離子模式下對(duì)樣本進(jìn)行分離和數(shù)據(jù)采集，圖1為各樣本總離子流圖，由圖可以看出，色譜峰基線平穩(wěn)，峰分離效果良好，儀器分析均信號(hào)強(qiáng)且穩(wěn)定性良好。

圖1 竹筍組(A)、竹莖組(B)、竹葉組(C)在正離子模式(1)和負(fù)離子模式(2)下的基峰強(qiáng)度色譜(BPI)Fig.1 Base peak intensity chromatograms(BPI)of root group(A)，stem group(B)，and leaf group(C)in positive ion mode(1)and negative ion mode(2)

2.2 竹子各部位的代謝物主成分分析

竹類(lèi)樣本進(jìn)行不同部位分組(圖2)，共檢測(cè)到1 112種代謝物，竹葉組共有497種代謝物，竹筍組251種代謝物，竹莖組364種代謝物，不同器官間共有38種物質(zhì)。

圖2 各組代謝物(Venn圖)Fig.2 Metabolites in each group(Venn graph) 注：Leaf：竹葉組；Root：竹筍組；Stem：竹莖組 Note：Leaf，bamboo leaf group.Root，bamboo shoot group.Stem，bamboo stem group

將數(shù)據(jù)進(jìn)行面積歸一化處理，處理后導(dǎo)入SIMCA-P軟件中進(jìn)行主成分分析(PCA)，用UV算法處理數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，擬合后得R2X=0.865，Q2=0.823，兩個(gè)參數(shù)值均>0.5，且數(shù)值相差不大，說(shuō)明擬合性較好，得PCA圖(圖3)。如圖3所示，所有樣品都處在95%的置信區(qū)間內(nèi)，且竹葉、竹筍和竹莖3組樣品各聚在一起，區(qū)分明顯。

圖3 主成分分析Fig.3 Principal component analysis 注：Leaf：竹葉組；Root：竹筍組；Stem：竹莖組 Note：Leaf，bamboo leaf group.Root，bamboo shoot group.Stem，bamboo stem group

2.3 竹子各組間的OPLS-DA分析

為篩選出組間的差異代謝物，將竹葉組、竹莖組和竹筍組數(shù)據(jù)處理后，得到OPLS-DA得分圖(圖4，圖5和圖6)。如圖所示，竹葉組、竹莖組和竹筍組的代謝產(chǎn)物明顯分離，表明各組之間存在顯著差異，全部樣品組都位于置信區(qū)間內(nèi)，同時(shí)參數(shù)R2Y和Q2都大于0.9(表1)，說(shuō)明模型的穩(wěn)定性較好，數(shù)據(jù)可靠。經(jīng)過(guò)OPLS-DA置換檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Q2點(diǎn)從左到右均低于最右邊的原始的藍(lán)色的Q2點(diǎn)，且Q2<0，R2和Q2的回歸線與橫坐標(biāo)交叉或者小于0，說(shuō)明評(píng)估模型沒(méi)有發(fā)生過(guò)擬合。以上結(jié)果表明OPLS-DA模型能有效區(qū)分各組樣本，可用于后續(xù)的差異成分分析。

圖4 竹葉組與竹筍組的OPLS-DA模型得分圖和置換檢驗(yàn)圖Fig.4 OPLS-DA model score map and replacement test chart of leaf group and root group

圖5 竹葉組和竹莖組的OPLS-DA模型得分圖和置換檢驗(yàn)圖Fig.5 OPLS-DA model score map and replacement test chart of leaf group and stem group

圖6 竹筍組和竹莖組的OPLS-DA模型得分圖和置換檢驗(yàn)圖Fig.6 OPLS-DA model score map and replacement test map of root group and stem group

表1 OPLS-DA模型的R2Y與Q2值

2.4 竹子不同部位的差異代謝物篩選

根據(jù)OPLS-DA生成的VIP值來(lái)篩選組間差異代謝物(VIP>1，P<0.05)，對(duì)竹葉、竹莖和竹筍分別進(jìn)行組間比較，在竹葉-竹筍組、竹莖-竹葉組、竹莖-竹筍組中分別篩選到80、85及40個(gè)差異代謝物。VIP值越大，分類(lèi)貢獻(xiàn)越大，越能表明差異代謝物對(duì)樣品組間的分類(lèi)影響強(qiáng)度，在此基礎(chǔ)上，繼續(xù)以VIP>3，P<0.05為指標(biāo)的差異代謝物，共篩選到21種顯著差異代謝物，主要包括脂肪酸和共軛物5種、十八烷酸類(lèi)4種、二十烷酸類(lèi)3種、黃酮類(lèi)3種、有機(jī)酸2種、糖類(lèi)以及其他4種物質(zhì)等(表 2，表3和表 4)。

再利用 SPSS 22.0 進(jìn)行變化差異倍數(shù)分析(fold change，F(xiàn)C)，由log2(FC)值可知，竹葉-竹筍組中除9，12，13-TriHOME、檸檬酸、9(10)-EpODE、甲基丙二酸、異青蒿素2″-醋酸酯、D-麥芽糖和龍膽苦苷，其余代謝物含量均是竹筍組樣品高于竹葉組。竹莖-竹葉組中除生物蝶呤、N-(3-oxo-hexanoyl)-homoserine lactone和5-hydroperoxy-7-[3，5-epidioxy-2-(2-octenyl)-cyclopentyl]-6-heptenoic acid，其余代謝物含量均是竹葉組樣品高于竹莖組。竹莖-竹筍組中除生物蝶呤和龍膽苦苷，其余代謝物含量均是竹筍組的樣品高于竹莖組。

表2 竹葉-竹筍組差異代謝物

表3 竹莖-竹葉組差異代謝物

表4 竹莖-竹筍組差異代謝物

2.5 代謝產(chǎn)物的聚類(lèi)熱圖分析

如圖6所示，顏色代表了代謝物的豐度高低。通過(guò)篩選出的差異代謝物將竹子各部位樣品進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果顯示，差異代謝物在3組樣品中的含量明顯區(qū)分，竹葉組的白三烯B4、甲基丙二酸、檸檬酸、D-麥芽糖、13-OxoODE、9(10)-EpODE、9，12，13-TriHOME、異青蒿素2″-醋酸酯等代謝物的含量相對(duì)較高。竹筍組的赤酮酸、9，10-DHOME、9S，12S，13S-trihydroxy-10E，15Z-octadecadienoic acid、9S，11R，15S-trihydroxy-2，3-dinor-13E-prostaenoic acid-cyclo[8S，12R]、methyl 8-[2-(2-formyl-vinyl)-3-hydroxy-5-oxo-cyclopentyl]-octanoate和奎寧酸含量最高。竹莖組的N-(3-oxo-hexanoyl)-homoserine lactone、5-hydroperoxy-7-[3，5-epidioxy-2-(2-octenyl)-cyclopentyl]-6-heptenoic acid、生物蝶呤和龍膽苦苷含量較高。

2.6 代謝通路分析

為探究食竹對(duì)大熊貓機(jī)體代謝調(diào)節(jié)所產(chǎn)生的作用機(jī)制，對(duì)篩選出的差異代謝物質(zhì)經(jīng) metaboanalys通路富集分析。MetPA平臺(tái)主要基于HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)和KEGG代謝通路，結(jié)合通拓?fù)浞治龊吐犯患治龅慕Y(jié)果，篩選出與實(shí)驗(yàn)的最相關(guān)的代謝通路，最終得到代謝通路影響因子圖(圖7)，共篩選出 6條相關(guān)的代謝通路。圖中圓圈表示所有匹配的代謝通路，圓圈的顏色和大小分別依據(jù)代謝通路的P值和通路影響值(pathy impact)確定的?；趇mpact值大于0.02對(duì)關(guān)鍵代謝途徑進(jìn)行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有5條關(guān)鍵代謝途徑。主要包括檸檬酸循環(huán)(citrate cycle)，淀粉和蔗糖代謝(starch and sucrose metabolism)，乙醛酸和二羧酸的代謝(glyoxylate and dicarboxylate metabolism)，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解(valine，leucine and isoleucine degradation)、花生四烯酸代謝(arachidonic acid metabolism)(圖8)。

3 討論

大熊貓屬于食肉目(Carnivora)動(dòng)物，雖其食性已高度特化為以竹類(lèi)為食，但仍然保留肉食動(dòng)物的消化系統(tǒng)特征[12]，而竹類(lèi)粗纖維含量較高且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較低，相對(duì)典型的食肉動(dòng)物消化系統(tǒng)，大熊貓無(wú)疑對(duì)竹子的消化利用率較低[13-14]。大熊貓?jiān)诓煌纳黼A段對(duì)營(yíng)養(yǎng)及能量的需求不同，為滿足機(jī)體營(yíng)養(yǎng)需要，大熊貓會(huì)采取最佳覓食策略即對(duì)主食竹在不同季節(jié)會(huì)采食不同部位[15]。

本文利用非靶向代謝組對(duì)采集的大熊貓主食竹各部位進(jìn)行分析，總共篩選出21個(gè)顯著差異代謝物質(zhì)，其中包括脂肪酸和共軛物5種、十八烷酸類(lèi)4種、二十烷酸類(lèi)3種、黃酮類(lèi)3種、有機(jī)酸2種、糖類(lèi)以及其他物質(zhì)4種等。熱圖分析發(fā)現(xiàn)差異代謝物在3組樣品中的含量明顯區(qū)分，竹葉組檸檬酸、D-麥芽糖、甲基丙二酸和黃酮類(lèi)物質(zhì)含量較高；竹筍組3種脂肪酸和共軛物，以及奎寧酸含量較高。竹莖組生物蝶呤和龍膽苦苷含量較高。

差異物質(zhì)進(jìn)行代謝通路的富集分析，得到5條通路較為顯著，分別為檸檬酸循環(huán)，淀粉和蔗糖代謝，乙醛酸和二羧酸的代謝，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解，花生四烯酸代謝。檸檬酸循環(huán)、淀粉和蔗糖代謝與乙醛酸和二羧酸的代謝都與能量代謝有關(guān)，且檸檬酸循環(huán)是機(jī)體將糖或其他物質(zhì)氧化而獲得能量的最有效方式；其主要參與的差異代謝物為檸檬酸和D-麥芽糖，且這兩種物質(zhì)在竹葉中含量較高，而大熊貓一年中采食竹葉的時(shí)間最長(zhǎng)，占比也較大[16]。Atapattu等[17]研究發(fā)現(xiàn)，檸檬酸能夠促進(jìn)胃蛋白酶的活動(dòng)，從而改善對(duì)蛋白質(zhì)和纖維的消化和吸收。除此外，檸檬酸能起到調(diào)味劑的作用，可直接刺激機(jī)體口腔味蕾細(xì)胞來(lái)促進(jìn)唾液分泌，增強(qiáng)食欲[18]，從而提高采食量，以促進(jìn)體內(nèi)鈣的排泄、沉積和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收[19]。D-麥芽糖能促機(jī)體對(duì)竹類(lèi)中鈣、鎂、鋅等礦物質(zhì)的吸收，也能促其進(jìn)腸胃蠕動(dòng)[20]，有利于大熊貓從竹葉中獲取必需營(yíng)養(yǎng)。

甲基丙二酸參與纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸屬于支鏈氨基酸(BCAA)，大熊貓須從食物中獲取的必需氨基酸。支鏈氨基酸可增加蛋白合成，可促進(jìn)相關(guān)激素的釋放，如生長(zhǎng)激素、胰島素和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1，以及利于維持一個(gè)合理的睪酮/皮質(zhì)醇比例[21]。野生大熊貓一般在3—5月交配，在此期間雄性大熊貓需要保持體能優(yōu)勢(shì)，雌性大熊貓需要能保證正常發(fā)情、正常受孕的激素水平[22]。而竹葉中富含甲基丙二酸，因此發(fā)情期需要采食大量竹葉來(lái)促進(jìn)血液中激素水平，從而提高其繁殖性能[23]。

圖7 差異代謝物熱圖Fig.7 Differential metabolite thermogram

圖8 差異代謝物通路富集分析Fig.8 Enrichment analysis of differential metabolite pathways

大熊貓?jiān)诮慌浜笫芫阎惭舆t1.5—4.0個(gè)月，這是其所獨(dú)有的妊娠生理特性[24]。此時(shí)各大山系均已發(fā)筍，竹筍組織鮮嫩、含水量以及蛋白質(zhì)含量高，而纖維素含量和木質(zhì)化程度低，且適口性較好，是該時(shí)段大熊貓的優(yōu)選蛋白質(zhì)食物。其富含的奎寧酸能抗病毒、抑制平滑肌收縮、降血脂等[25]，當(dāng)雌性所食竹筍營(yíng)養(yǎng)積累到一定程度，可利于受精卵著床和胚胎的快速發(fā)育。野生大熊貓妊娠期為97—163 d，通常于9—10月產(chǎn)仔，此時(shí)當(dāng)年生幼竹新葉易取食，而竹葉中都含較高的黃酮類(lèi)化合物[26]，大熊貓幼仔的主要營(yíng)養(yǎng)以及早期的免疫防護(hù)均來(lái)源于母乳，有研究表明，黃酮類(lèi)化合物被動(dòng)物攝食后，可在小腸葡糖苷酶的作用下水解，從而在小腸黏膜細(xì)胞中代謝形成雌馬酚(equol)，發(fā)揮雌激素的功能，有利于促進(jìn)雌性大熊貓產(chǎn)仔后的乳汁分泌[27-28]，幼仔也通過(guò)母乳提高自身免疫力、抗病毒和抗菌等。

除此，竹莖中富含的龍膽苦苷具有抗原蟲(chóng)，保肝，刺激胃液和胃酸的分泌等功效[29]。生物蝶呤具有提高免疫力、抗炎癥等功效[30]，有利于雌性產(chǎn)仔后在育幼階段來(lái)彌補(bǔ)產(chǎn)仔過(guò)程的能量耗損和哺乳的營(yíng)養(yǎng)需求。大熊貓幼仔發(fā)育需要度過(guò)漫長(zhǎng)的冬季，1歲以后開(kāi)始吃竹葉[16]，竹葉中富含的白三烯B4、前列腺素E2參與了花生四烯酸代謝，花生四烯酸作為其合成的直接前體，具有能誘發(fā)細(xì)胞的生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)免疫功能，促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)以及機(jī)體發(fā)育等重要功能[31]。因此，本研究發(fā)現(xiàn)大熊貓選擇消化率較低且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值低的竹類(lèi)為食，除竹類(lèi)易獲取以及營(yíng)養(yǎng)成分較穩(wěn)定外，采食竹子不同部位可滿足大熊貓?jiān)诓煌黼A段的需求。

4 結(jié)論

本文通過(guò)應(yīng)用非靶向代謝組學(xué)對(duì)苦竹、方竹和刺黑竹的63個(gè)樣品進(jìn)行分析，結(jié)果表明竹子不同部位存在代謝差異，共篩選出21種顯著差異代謝物，結(jié)合差異物質(zhì)的生理作用，我們可進(jìn)一步解釋大熊貓?jiān)诓煌L(zhǎng)階段取食竹子的不同部位，來(lái)滿足自身的生理需求、生長(zhǎng)發(fā)育的原因。竹子的代謝物含量不僅在不同部位存在差異，在其不同生活史階段和不同環(huán)境中也會(huì)受到影響，后期研究中，我們將在非靶向代謝組的基礎(chǔ)上，利用靶向代謝組學(xué)對(duì)竹子中的代謝物質(zhì)做進(jìn)一步定性和定量研究。