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    一種香菇菌種保藏方法初探

    2020-10-25 13:55:14李正鵬章?tīng)t軍于海龍李巧珍董浩然
    食用菌 2020年5期
    關(guān)鍵詞:離心管米粒香菇

    姜 寧 李 玉 周 峰 李正鵬 章?tīng)t軍 于海龍 李巧珍 董浩然

    (上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所/農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心/國(guó)家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心/農(nóng)業(yè)部應(yīng)用真菌資源與利用重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室/上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室,上海奉賢201403)

    香菇(Lentinula edodes)又名冬菇,是一種重要的食用真菌,不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì),還具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒和提高免疫力等藥用功效[1]。近年來(lái),隨著香菇行業(yè)的迅速發(fā)展,生產(chǎn)中的一些問(wèn)題也逐漸突顯。香菇菌種作為生產(chǎn)的源頭,其質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到香菇培養(yǎng)的各個(gè)環(huán)節(jié)以及出菇子實(shí)體的產(chǎn)量和質(zhì)量。一個(gè)優(yōu)良的菌株被選育出來(lái)以后,必須保持其優(yōu)良性狀不變或盡可能地少變慢變,才不至于降低生產(chǎn)性能,才能長(zhǎng)期在生產(chǎn)中使用[2]。因此,尋找適用于香菇的菌種保藏方法,其重要性不言而喻。

    目前香菇菌種常用的保藏方法主要有試管斜面?zhèn)鞔2?、液氮保藏、石蠟油封藏、冷凍干燥保藏等[3-9]。這些方法或者因?yàn)檎紦?jù)的保藏空間太大,增加了保藏成本;或者因?yàn)檗D(zhuǎn)管傳代次數(shù)過(guò)多,導(dǎo)致菌種的退化;或者因?yàn)樗柙O(shè)備價(jià)格昂貴,操作技術(shù)復(fù)雜,不適用于生產(chǎn)企業(yè)。因此,探究一種操作簡(jiǎn)便、高效廉價(jià)、不占據(jù)過(guò)大的保藏空間的香菇菌種保藏方法至關(guān)重要。

    為此,筆者探索一種以小米粒為培養(yǎng)基質(zhì),保藏容器為2 mL 離心管的香菇菌種保藏方法。該方法可以有效降低保藏菌種的成本,并且操作簡(jiǎn)單,占用保藏空間小,保藏效果良好,便于科研單位及企業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。

    1 材料與方法

    1.1 供試菌株

    香菇雙核體菌株滬香F2,香菇原生質(zhì)體單核體菌株220 均保藏于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所;小米粒購(gòu)自超市,試管、三角瓶均購(gòu)自江蘇省海門市三和華興實(shí)驗(yàn)玻璃儀器廠。

    1.2 小米粒培養(yǎng)基質(zhì)制備

    取新鮮小米粒洗凈,蒸餾水浸泡20~30 min,至小米粒微軟,散開(kāi)到干凈的紗布上,用紗布吸干表面多余水分,分裝到250 mL 三角瓶中,每瓶30 g,121 ℃高壓滅菌30 min,pH自然[10]。

    1.3 保藏菌株培養(yǎng)

    將供試菌株從保藏庫(kù)中取出,轉(zhuǎn)接至含PDA 的培養(yǎng)皿中,25 ℃避光培養(yǎng),待菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí),用勻漿杯打碎,勻漿杯預(yù)加入50 mL PDB(PDA 不加瓊脂)培養(yǎng)基,隨后加入小米粒培養(yǎng)基質(zhì)中,繼續(xù)25 ℃避光培養(yǎng),培養(yǎng)過(guò)程中每天將瓶?jī)?nèi)小米粒搖勻,使菌絲均勻分在小米?;|(zhì)上,培養(yǎng)至小米粒微白(圖1)。

    圖1 待保藏菌株用小米?;|(zhì)培養(yǎng)

    1.4 試驗(yàn)方法及處理

    將小米粒分裝到2 mL 離心管中(圖2),每支離心管加入40~50 粒小米粒。共設(shè)置7 組處理,處理①:25 ℃保藏;處理②:4 ℃保藏;處理③:離心管中加入1 mL PDB 培養(yǎng)基,4 ℃保藏;處理④:離心管中加入 1 mL 甘油,4 ℃保藏;處理⑤:-20 ℃保藏;處理⑥:-80 ℃保藏;處理⑦:離心管中加入1 mL 甘油,-80 ℃保藏。

    圖2 小米粒分裝到2 mL離心管中

    圖3 不同保藏方法處理后的小米粒轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上

    圖4 不同保藏方法處理后的菌種萌發(fā)情況

    1.5 觀察記錄及數(shù)據(jù)分析

    保藏6個(gè)月、12個(gè)月后,將不同方法保藏處理的小米粒菌種用鑷子單個(gè)挑出,用無(wú)菌濾紙吸干甘油和PDB 培養(yǎng)基,分別接種于PDA 平皿培養(yǎng)基上,25 ℃避光培養(yǎng)(圖3)。觀察記錄菌絲的生長(zhǎng)狀況,萌發(fā)時(shí)間和萌發(fā)率以及生長(zhǎng)速度。菌絲生長(zhǎng)速度采用菌落直徑測(cè)定法測(cè)定[11]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同方法保藏處理對(duì)菌種萌發(fā)的影響

    不同方法保藏處理6 個(gè)月和12 個(gè)月后,經(jīng)解凍活化香菇單、雙核體菌種萌發(fā)情況如圖4 和表1 所示。不同方法處理后的保藏效果不同,4 ℃保藏以及離心管中加入1 mL PDB 培養(yǎng)基后4 ℃保藏,菌種萌發(fā)時(shí)間短,萌發(fā)率高,保藏效果好,在保藏6 個(gè)月后,萌發(fā)率達(dá)100%。25 ℃保藏,-20 ℃保藏以及離心管中加入1 mL 甘油后4 ℃保藏,萌發(fā)率低,保藏效果差,并且在保藏12個(gè)月后,菌種已經(jīng)無(wú)法萌發(fā)。同種方法處理保藏的香菇單、雙核體菌種,雙核體的萌發(fā)率高于單核體。

    2.2 不同方法保藏處理對(duì)菌種菌絲生長(zhǎng)的影響

    由表2 可知,不同方法保藏處理菌種6 個(gè)月、12個(gè)月后,其轉(zhuǎn)接后菌絲生長(zhǎng)存在差異。4 ℃保藏的菌絲濃白,長(zhǎng)勢(shì)旺盛,生長(zhǎng)速度最快,其次是加入1 mL PDB 培養(yǎng)基后4 ℃保藏;離心管中加入1 mL 甘油后4 ℃保藏的菌絲生長(zhǎng)緩慢,菌絲稀疏活力差,保藏效果差。

    表1 不同方法保藏處理后菌種的萌發(fā)情況

    表2 不同方法保藏處理后菌種轉(zhuǎn)接培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)速度

    3 小結(jié)與討論

    香菇菌種在自然條件下,由于環(huán)境等因素會(huì)誘發(fā)基因發(fā)生突變,這種突變積累到一定程度后會(huì)導(dǎo)致木質(zhì)素、纖維素等酶合成和表達(dá)受到影響,酶活力下降,菌絲對(duì)木質(zhì)素和纖維素的利用降低,最終導(dǎo)致菌絲長(zhǎng)勢(shì)差,生長(zhǎng)速度減慢,影響子實(shí)體的發(fā)育。因此生長(zhǎng)速度是評(píng)價(jià)菌種保藏好壞的一個(gè)重要指標(biāo)。

    綜合菌種的萌發(fā)時(shí)間、萌發(fā)率和生長(zhǎng)速度,4 ℃保藏效果最好,保藏12 個(gè)月后,雙核體菌株的萌發(fā)率達(dá)到95%,單核體菌株的萌發(fā)率為85%;加入1 mL PDB 培養(yǎng)基后4 ℃保藏效果次之;-20 ℃保藏6個(gè)月后,萌發(fā)率僅為30%,12 個(gè)月后,菌株不能萌發(fā),保藏效果最差。此方法操作簡(jiǎn)單,不需要特種設(shè)備,也不需要定期轉(zhuǎn)管,耗費(fèi)大量的人力和時(shí)間,并且保藏菌種所需的空間小,極大地降低了保藏成本,可以作為一種長(zhǎng)期保藏香菇菌種的方法,適用于科研單位及企業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。

    在不同處理的保藏方法設(shè)計(jì)中,作者沒(méi)有采用低溫液氮處理,因?yàn)?,在?shí)際的生產(chǎn)應(yīng)用中,液氮罐投入成本較高,采用的程序降溫法操作繁瑣,并且對(duì)于日常生產(chǎn)的菌種,不需要保存的時(shí)間太久。該保藏方法也可拓展到其他的食用菌中,為食用菌的菌種保藏提供一個(gè)新思路。

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