HPLC法測定芍藥花瓣中紫云英苷的含量

李洪芹，馬昌豪，王澤海，羅盼生*

(1.菏澤學院，山東 菏澤 274015；2.菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院，山東 菏澤 274015)

芍藥(PaeonialactifloraPall.)是毛茛科芍藥屬多年生宿根草本植物，原產(chǎn)于東南亞，其根可以入藥，是中藥材白芍和赤芍的重要來源，具有重要的藥用價值，同時具有較高的觀賞價值[1]。菏澤作為芍藥的四大主產(chǎn)區(qū)之一，具有悠久的種植歷史，其品種多、花色豐富、花型多變。相關文獻[2-4]研究表明芍藥富含黃酮、單萜類、三萜及甾體類化合物，此前研究多集中芍藥的根中的各類成分和藥理作用，并未對花瓣的質(zhì)量情況進行研究，在前期對芍藥花瓣的指紋圖譜研究基礎上，采用高效液相色譜法對芍藥花瓣中的紫云英苷含量進行測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-2030高效液相色譜儀、XS-105電子天平(梅特勒公司)、FRQ-1006HT超聲波清洗器(杭州法蘭特)

1.2 試藥

紫云英苷(批號：CIV-471295、純度為98.96%)購于斯坦福標準物質(zhì)，乙腈(色譜純，默克化工)、磷酸(色譜純，天津科密歐)。

1.3 樣品

樣品來自于菏澤曹州牡丹園，經(jīng)菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院羅盼生主任醫(yī)師鑒定為毛茛科植物芍藥的花瓣。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法學驗證

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

流動相：以乙腈為流動相A，0.1%磷酸水溶液為流動相B，按照表1進行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫

檢測波長：347 nm，流速：1 mL/min。理論塔板數(shù)按紫云英苷峰計算，應不得低于3000，結(jié)果見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.1.2 供試品溶液制備

稱取芍藥花瓣粉末(新鮮花瓣，50℃干燥至恒定重量，粉碎，過3號篩)1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入65%乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理30 min(功率250 W，頻率40 kHz)，冷卻至室溫，用65%乙醇補足失重，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 對照品溶液制備

稱取紫云英苷對照品8.42 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，作為儲備液，精密量取儲備液3 mL置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，作為對照品溶液。

2.1.4 線性關系考察

精密量取紫云英苷對照品儲備液3 mL至10 mL量瓶中，在2.1.1色譜條件下分別進樣2、8、10、15、20、30 μL，以峰面積值為縱坐標(y)，進樣量(μg)為橫坐標(x)繪制標準曲線，并進行回歸，得標準曲線為y=18353.21x-16289.01(r=0.9997)，結(jié)果紫云英苷在0.05～0.75 μg范圍內(nèi)線性關系良好。

2.1.5 精密度考察

在2.1.1色譜條件下，精密吸取對照品10 μL，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，紫云英苷的RSD為0.63%，表明儀器具有良好的精密度。

2.1.6 重復性考察

取芍藥干燥花瓣的粉末，按照2.1.2項下供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，參照2.1.1項色譜條件下測定，結(jié)果紫云英苷的質(zhì)量分數(shù)的 RSD為1.20%。表明該方法具有良好的重復性。

2.1.7 穩(wěn)定性考察

取供試品溶液一份，分別在2.1.1項色譜條件下于2、12、36、48 h進樣，測定紫云英苷峰面積，其RSD為0.81%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.8 加標回收率考察

取本次芍藥花瓣(紫云英苷含量為0.092%)粉末適量，稱取6份，每份0.5 g，精密稱定，每份精密加入對照品儲備液(0.8332 mg/mL)0.50 mL，參照2.1.2項方法制備供試品溶液，精密吸取上述溶液10 μL，測定加樣回收率，結(jié)果表明該方法的準確度符合要求。結(jié)果見表2。

表2 加標回收率結(jié)果(n=6)

2.2 結(jié)果

取3份樣品，分別按2.1.2項下制備樣品溶液，照2.1.1項下色譜條件測定紫云英苷含量，3份樣品含量分別為0.092%、0.086%、0.090%。

3 討論

紫云英苷在347 nm處有最大的紫外吸收，故選擇347 nm為檢測波長。前期考察了甲醇水系統(tǒng)、乙腈水系統(tǒng)、乙腈磷酸水系統(tǒng)和乙腈甲酸水系統(tǒng)，最終選擇乙腈磷酸水系統(tǒng)梯度洗脫，保證紫云英苷的分離度和理論塔板數(shù)均符合要求。

近年來，隨著對傳統(tǒng)非藥用部位資源性化學成分的深入研究，傳統(tǒng)非藥用部位的潛在資源價值逐漸顯現(xiàn)并越來越引起人們的高度重視，芍藥是中藥材赤芍和白芍的來源之一，其花瓣在觀賞期過后自然掉落，多作為廢棄物進行處理，并未對其再利用。前期研究發(fā)現(xiàn)芍藥花花瓣中總黃酮含量較高，黃酮具有抗氧化、抗衰老等多種功效，紫云英苷具有抗氧化、促進成骨細胞增殖和分化、對腫瘤細胞的移至作用等藥理作用[5-6]，表明芍藥花瓣具有潛在的經(jīng)濟價值[7]，對其化學成分及相關藥理作用進行深入研究，可以為后續(xù)開展芍藥花瓣的再利用研究提供技術參考，為芍藥種植產(chǎn)業(yè)的深加工提供指導方向，為藥材生產(chǎn)過程產(chǎn)生的資源儲量大、生產(chǎn)成本低的非藥用部位及深加工產(chǎn)業(yè)化過程產(chǎn)生的藥渣等副產(chǎn)物的利用形成產(chǎn)業(yè)化、規(guī)模化奠定理論基礎。